ПТР термоциклде жүзеге асырылады - құбырларды мезгіл-мезгіл салқындатуды және жылытуды қамтамасыз ететін құрылғы, әдетте дәлдігі кемінде 0,1 ° С.
Заманауи амплификаторлар күрделі бағдарламаларды, соның ішінде «ыстық бастама» бағдарламасын қоюға мүмкіндігі бар.
ПТР қажет:
Күшейтілетін ДНҚ бөлігі бар ДНҚ үлгісі.
Қажетті ДНҚ фрагментінің әртүрлі тізбектерінің қарама-қарсы ұштарын толықтыратын екі праймер.
Термостабельді ДНҚ полимераза - бұл ДНҚ полимерленуін катализдейтін фермент. ПТР-да қолдануға арналған полимераза ұзақ уақыт бойы жоғары температурада белсенді болып қалуы керек, сондықтан термофилдерден оқшауланған ферменттер - Термус акваториясы (Taq полимераза), Пирококк фуросусы (Pfu полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo polymerase) және басқалары қолданылады.
ДНҚ тізбегін тарқатуға мүмкіндік беретін екі тізбекті ДНҚ шаблонын 94–96 ° C дейін қыздырады (немесе егер термостабельді полимераза қолданылса, 98 ° C).
Бұл кезең денатурация деп аталады, өйткені екі ДНҚ тізбегі арасындағы сутегі байланысы бұзылады.
Кейде, бірінші цикл басталғанға дейін (полимеразаны қоспас бұрын) реакциялық қоспаны 2-5 минут алдын ала қыздырады. матрица мен праймерлердің толық денатурациясы үшін. Бұл әдіс ыстық бастама деп аталады, ол реакцияның спецификалық емес өнімдердің санын азайтуға мүмкіндік береді.
Ренатурация (күйдіру)
Тізбектер ажыраған кезде температураны төмендетеді, праймерлер бір тізбекті қалыппен байланыса алуы үшін. Бұл кезең күйдіру деп аталады.
Күйдіру температурасы праймерлердің құрамына байланысты және әдетте олардың еру температурасынан 4-5 ° C төмен температурада таңдалады. Кезең уақыты - 0,5-2 минут.
Күйдіру температурасын дұрыс таңдамау праймерлердің қалыпқа дұрыс байланыспауына әкеледі (температура жоғары болғанда) немесе дұрыс емес жерде байланыстыруға және спецификалық емес өнімдердің пайда болуына (төмен температурада) әкеледі.
Синтез (Элонгация)
ДНҚ-полимераза матрицалық тізбекті, праймерді бастама ретінде қолданып көшіреді. Бұл ұзарту кезеңі - элонгация.
Полимераза екінші тізбектің матрицамен байланысқан және матрица бойымен қозғалатын праймердің 3'соңынан синтезін бастайды.
Элонгация температурасы полимеразаға байланысты. Жиі қолданылатын Taq және Pfu полимеразалары 72 ° C температурада ең белсенді.
