Жаратылыстану ғылымдары факултеті
жүктеу/скачать 323,36 Kb.
|
молекулалық биология бөж1 (автовосстановление)
- Бұл бет үшін навигация:
- 4-сурет. SLIC клондау схемасы.
| SLIC клондау әдісі
Стив Элледж және қажымас Мами Ли ғылыми қауымдастықты тағы да түпнұсқа клондау әдісімен қуантты. Жаңа әдіс SLIC (тізбегі мен лигациядан тәуелсіз клондау) деп аталады. Жаңа өнім белгілі LIC (ligation-independent cloning) әдісінің модификациясы – лигазаны қолданбай клондау(4-сурет) Классикалық LIC әдісін қолданып векторға ДНҚ фрагментін енгізу үшін вектор мен кірістіруді араластыру жеткілікті, олардың ұштарында бір-бірін толықтыратын ұзартылған бір тізбекті аймақтар бар. Бұл жағдайда кірістіру векторға «жабысып», екі тізбекте никтері бар рекомбинантты плазмиданы құрайды. Алынған плазмида E. Coli-ге айналады, оның жөндеу жүйесі плазмиданың қалыпты құрылымын қалпына келтіреді. S LIC әдісі тек айырмашылығы бар LIC әдісімен бірдей: вектор мен кірістірудің «адгезиясы» RecA протеинінің қатысуымен жүзеге асырылады. Әдістің бұл кішігірім модификациясы айтарлықтай жоғары шығымдылыққа қол жеткізуге (1 нг вектор 3900 түрлендіргіш шығара алады), сонымен қатар клондау процедурасының өзін жеңілдетуге мүмкіндік береді. Сонымен, егер классикалық LIC әдісі үшін вектор мен кірістірудің бір тізбекті кесінділерінің өлшемін дәл реттеу қажет болса (соңында вектор мен кірістірудің түйіскен жерінде никалар алынады), онда SLIC әдісі бар болуына мүмкіндік береді. Ұзартылған аралықтардың . 4-сурет. SLIC клондау схемасы. RecA факторы ішек таяқшасын қалпына келтіру және рекомбинациялаудың негізгі факторларының бірі болып табылады. ДНҚ-ның бір тізбекті аймағымен байланыса отырып, RecA «тізбекті алмасу» процесін ынталандырады (бұл процесс барысында бір ДНҚ молекуласының бір тізбекті аймағы басқа ДНҚ молекуласының гомологты қос тізбекті аймағына енгізіледі, бұл D-цикл). Клондау сатысында RecA in vitro қосу E. coli-ге in vivo плазмидті тиімдірек жөндеуге мүмкіндік береді. Сәтті клондау үшін вектор мен кірістіру жиектерінде 30 нуклеотид гомологиялық аймақтарының болуы қажет. Нуклеотидтерді қоспай, Т4 ДНҚ-полимераза көмегімен бір тізбекті аймақтарды алу ұсынылады. SLIC көмегімен кірісті төмендетпей бір кезеңде бір векторға бірден 5 кірістіруді қысуға болады. Ақырында, жоғары кірістілік кітапханаларды клондау кезінде SLIC әдісін қолдануға мүмкіндік береді. жүктеу/скачать 323,36 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|