Лекции по фитопатологии учебное пособие для аспирантов сельскохозяйственного направления
жүктеу/скачать 1,13 Mb. Pdf көрінісі
|
3 3
| Рис. 3. Капельный метод
серологической диагностики: слева – контроль (реакция отрицательная); справа – хлопьевидный осадок (реакция положительная) метод двойной диффузии в агаровом геле используют для определения сферических и других мелких вирусов. При этом в одни лунки, вырезанные в слое агара, в чашках Петри добавляют антисыворотку, а в другие – очищенный сок растения. Антитела и вирусные частицы диффундируют в геле навстречу друг другу и образуют в месте встречи отчетливые линии преципитации; при использовании метода радиальной иммунодиффузии антисыво- ротку добавляют непосредственно в агар, а лунки заполняют соком. При по- ложительной реакции вокруг лунок образуются преципитаты в форме колец; метод адсорбции основан на том, что перед реакцией с антигеном ан- титела связывают каким-либо инертным материалом с крупными частицами, например латексом. При реакции с антигеном происходит хорошо заметная агглютинация всего комплекса; наиболее высокочувствительной, позволяющей получить количе- ственные оценки модификацией является иммуноферментный анализ (ИФА), основанный на связывании антител определенными метками – ферментами. В лунки микроплаты из полимерных материалов добавляют антисыворотку и очищенный сок, содержащий вирусы – антигены; между ними происходит первая иммунная реакция. Затем на фиксированный комплекс антиген – ан- титело наносят раствор антител, связанных ферментом (фосфатаза или пе- роксидаза); при этом меченные ферментом антитела наслаиваются на детер- минанты молекул антигена и начинается вторая иммунная реакция. После добавления соответствующего ферментного субстрата происходит фермент- 30 ная реакция по каталитическому расщеплению субстрата, что обнаруживает- ся с помощью фотометра по цветной реакции. Метод электронной микроскопии дает возможность быстро получить информацию о наличии вирусных частиц в растении. С помощью электрон- ных микроскопов на ультратонких срезах пораженных частей растений мож- но установить форму, строение и даже размеры вирусов. Трансмиссионный электронный микроскоп используют для серийных анализов вирусной ин- фекции в соке растений. С помощью иммуноэлектронной микроскопии мож- но обнаруживать вирусные частицы с наслоившимися антителами. Метод гель-электрофореза основан на электрофоретическом разделе- нии предварительно очищенных нуклеиновых кислот вируса (вироида) или его белкового компонента в полиакриламидном геле при силе тока 3 и 6 мА с последующим окрашиванием красителем зон соответственно нуклеиновых кислот или белков. При сравнении высоты полученных окрашенных линий с высотой стандартных, или маркерных, зон определяют массу (соответствен- но и размеры) вирусных структур. Молекулярно-генетические методы основаны на знании строения мо- лекулы РНК вируса или вироида. Отличаются высокой надежностью, чув- ствительностью, быстротой. К недостаткам этих методов относятся высокая стоимость реактивов и оборудования для проведения диагностики, а также необходимость предварительного изучения генетических кодов патогенов. Наиболее распространенный тест – амплификация (умножение) видо- специфичных последовательностей РНК при полимеразной цепной реакции (ПЦР), в ходе которой отдельные химически синтезированные фрагменты РНК (праймеры), характерные только для одного вида или рода вирусов, участвуют в ферментативном воспроизведении соответствующих участков матричной РНК, выделенной из зараженного растения. Продукты ПЦР с по- мощью ферментов многократно клонируют (амплифицируют) при опреде- ленных режимах температур в циклическом термостате, при этом исходное число копий выбранного фрагмента РНК возрастает в миллионы раз. Затем их обнаруживают методом гель-электрофореза или иммунофлуоресценции. Несмотря на сложность и дороговизну, ПЦР-диагностика – перспективный метод, в десятки раз более чувствительный, чем иммунохимические методы. Он позволяет выявлять и идентифицировать новые вирусы и их штаммы. Метод ДНК-зондов – другая модификация молекулярно-биологичес- кого метода, также основана на принципе комплементарности видоспеци- фичных последовательностей нуклеиновых кислот. Синтезируют зонды, ко- торые «узнают» определенные нуклеотидные последовательности РНК виру- са. В зависимости от выбора зондов можно дифференцировать роды, виды и штаммы вирусов. К методу пересадки растений на другой участок прибегают для под- тверждения или опровержения вирусной природы заболевания. Например, для определения причин хлороза растений их можно пересадить на заведомо благоприятную почву. Если заболевание неинфекционное, то через некото- рое время у растений восстановится типичная зеленая окраска. При вирусном заболевании хлороз сохранится. Метод включений – один из самых простых методов, не требующих дорогостоящего оборудования. Развитие некоторых вирусов в клетках расте- 31 ния сопровождается образованием в них скопления вирусных частиц (вклю- чений, или кристаллов Ивановского), которые обнаруживаются с помощью обычного светового микроскопа. Каждому виду вируса свойственна своя форма вирусных включений, образующихся обычно в клетках волосков или эпидермиса листьев. Например, для вируса табачной мозаики характерны иг- ловидные и гексагональные кристаллы; для Х-вируса картофеля и вируса мо- заики пшеницы типично образование сферических аморфных тел. Для выявления зеленой крапчатой мозаики огурца, скручивания листь- ев картофеля и некоторых других болезней применяют химические аналити- ческие методы диагностики в пораженных тканях растений. жүктеу/скачать 1,13 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|