Молекулалық биология дәрістер жиынтығы Кіріспе
жүктеу/скачать 0,87 Mb.
|
molekulalyk biologiya alpamysova gulzhayna
| Дәріс жоспары:
Гомологиялық рекомбинация. Рекомбинация типтері. Кроссинговердің молекулалық механизмдері. Рекомбинацияға қатысатын ферменттер. Гендк инверсия. Генетикалық рекомбинацияның мәні – екі хромосоманың өзара гендерімен алмасуында. Екі немесе одан көп тұқым қуатын анықтауышы бар клетканың немесе организмнің пайда болуына әкеп соғатын кез келген процесті 1958 жылы Понтекорво рекомбинация деп атады. Міндетті түрде сүтқоректілердің жыныс клеткалары пайда болғанда, мейоздың барысында гомологты хромосомалар гендерімен алмасады (кроссинговер – айқасу құбылысы). Осы алмасулар ұрпақтарға берілетін тұқым қуатын белгілердің араласуын түсіндіруге мүмкіндік береді. Гендер алмасуын, сондай-ақ клеткаға «бөтен» генді енгізуді генетикалық рекомбинация арқылы in vitro организмнен тыс жасауға болады. 1972 жылы П. Бергтің лабораториясында (АҚШ, Станфорд унивесритеті) ең бірінші рекомбинантты деп аталатын будан ДНҚ молекуласы алынды. Оның құрамына лямбда (λ) бактериофагының геномы мен SV 40 вирус геномы кірді. Организмнен тыс рекомбинация әдісі, әр түрдің ДНҚ-ларын (табиғи немесе жасанды) бөліп алып, оларды бір-бірімен қосуды, содан кейін осы рекомбинантты ДНҚ-ны тірі клеткаға енгізіп, жаңа белгінің пайда болуын, мысалы, ерекше белок синтезін жүргізуді көздейді. Мұндай эксперименттердің мақсаты ДНҚ-дағы белгілі бір нуклеотидтер жүйелілігін «векторға» енгізіп, кейін клетканың ішінде жұмыс істеткізу. ДНҚ фрагментін вестормен жалғастыру төмендегі жолдармен жүргізіледі: рестрикциялық эндонуклеазалардың қатысуымен пайда болған ДНҚ-ның жабысқақ ұштары арқылы; 2) ДНҚ-ның әрбір тізбегіне қосымша полинуклеотидтер фрагменттерін синтездеу (поли-А; поли-Т); 3) Т4- лигаза ферментінің көмегімен тұқыл ұштарын жалғау. 1974 жылдан бастап рекомбинантты ДНҚ алу жұмыстары көптеп жүргізілді. Гомологиялық рекомбинация. Рекомбинация – алғашқы ДНҚ молекулалардың үзілуі мен қайта байланысуы есебінен ДНҚ-ның жаңа бірізділіктерінің түзілу процессі. Жалпы немесе гомологиялық рекомбинация вирустар мен бактериялардан бастап көпжасушалы эукариоттарға дейінгі тірі ағзалардың барлығына тән. Гомологиялық рекомбинация кезінде гомологиялық, яғни бірізділіктері өте ұқсас ДНҚ молекулаларының бөліктері арасында алмасу жүзеге асады. Сонымен, жалпы рекомбинацияға эукариоттарға мейоз кезінде гомологиялық хромосомалар арасындағы алмасу және Т4 бактериофагы ДНҚ репликациясының рекомбинациялық инициациясы жатады. Гомологиялық рекомбинация кезінде жаңа бірізділіктер пайда болмайды. Тек сол бір бірізділіктің ұқсас нұсқалары көшіріледі. Сонымен қатар, ақуызды кодтайтын екі ұқсас гендер арасындағы гомологиялық рекомбинацияда екі рекомбинациялық өнімдер бұзылуға ұшырамайды. Басқаша айтқанда гомологиялық рекомбинацияда рекомбинациялық молекулалардың бірдей бөліктерін өзара тану қамтамасыз етіледі. ДНҚ-ның рекомбинациялық молекулалары арасында гомологтарды өзара іздеу процесі түрлі рекомбинациялық дуплекстердің ДНҚ тізбектері арасында комплементарлық жұптасу нәтижесінде қамтамасыз етіледі. Қазіргі таңда гомологиялық рекомбинация Холидей құрылымы немесе полухиазма деп аталатын аралық қосылыстың түзілуі арқылы жүзеге асады. Полухиазмада түрлі аналық ДНҚ молекулаларының бірізділікті бөліктері арасындағы комплементарлы жұптасу нәтижесінде жүзеге асырылады. Гетеродуплексті ДНҚ тзбегі бір-біріне толық комплементарлы болмауы мүмкін. Рекомбинация нәтижесінде түзілген гетеродуплексті аудандардың тағдыры 2 жағдайда болады: 1) егер гетеродуплекстің жұптаспаған негіздері репарацияға ұшырамасы, онда репликациядан кейін ДНҚ-ның әр бір тізбегі өзі пайда болған ДНҚ молекуласындағыдай бірізділікті дуплекс береді; 2) егер жұптаспаған негіздердің репарациясы жүзеге асатын болса, гетеродуплекстің екі тізбегінің біріндегі информация жоғалады және екінші тізбектің информациясымен алмасады. Екі мүмкін рекомбинациялық өнімнің бірінің жойылуы және екіншісіне айналуы арқылы жүзеге асатын рекомбинация нұсқасы гендік конверсия деп аталады. Рекомбинация типтері. Рекомбинацияның негізінен 2 типі бар: гомологиялық рекомбинация және сайт-арнайы рекомбинация. Гомологиялық рекомбинация жоғарыда сипатталған. Сайт-арнайы рекомбинация – гомологиялық рекомбинация сияқты гомологиялық бөліктерді қажет етпейді. Брақ сайт-арнайы рекомбинациясының жүруі үшін қатаң анықталған ДНҚ бірізділіктері және арнайы ферментативті аппарат қажет. Әр бір жағдайда сайт-арнайы рекомбинация өзінің жеке қызметін атқарады, және әр бір жағдайда ДНҚ-ның бірізділіктері де түрліше болады және ферменттері де бір-бірінен ажыратылады. Сондықтан сайт-арнайы рекомбинацияның түрлі жүйелерін жеке қарастыру қажет. Мысалы, E.coli Р1 фагының сайт-арнайы рекомбинациясы. Р1 фагі лизогенді жағдайда жасуша хромосомасына интеграцияланбайды, тек автономды төменкөшірмелі плазмид түрінде болады. Бұл плазмидтердің тұқымқуалауының тұрақтылығы оның бөліну кезінде ұрпақ жасушаларға реттелген сегрегациясымен байланысты. Кроссинговердің молекулалық механизмдері. Эукариоттарда мейоз кезінде ата-ана ағзасынан алынған гомологиялық хромосомалар түрлі жасушаларға беріледі. Ұрпақ жасушасына гомологиялық хромосомалардың дұрыс берілуі гомологиялық хромосомолардың бір-бірін танып, жұптасуымен қамтамасыз етіледі. Мейоздың рекомбинациясы рекомбинациялық желілер деп аталатын арнайы құрылымдарда жүзеге асады. Гомологиялық хромосомалардың рекомбинацялық алмасуы, яғни кроссинговер мейозда маңызды роль атқарады. Мейоздық бірінші бөліну кезінде хромосомалар конденсацияланады, бұл кезде ұқсас хроматидтер бірге жабысады, бірақ кроссинговер нәтижесінде ұсас емес хроматидтер арасында гомологиялық хромосомалар да хиазма деп аталатын кроссинговер бөлігінде бір-бірімен байланысады. 4. Рекомбинацияға қатысатын ферменттер. Гомологиялық рекомбинация RecА (Молекулалық массасы 40 кД) ДНҚ-ға тәуелді АТФ-аза. Ол ДНҚ дуплексінің бір тізбегін гомологиялық тізбекпен алмастыруға қабілетті. RecА әсерінен Д-тесіктер пайда болады. Д-тесіктің пайда болу реакциясы былай жүреді: RecА-ақуыз біртізбекті ДНҚ-ны көмкереді, сосын бұл комплекс екі тізбекті ДНҚ-мен байланысады. Бір тізбекті дуплексі бойымен қозғалады да, гомологиялық бөлікті тапқанша жалғасады. Іздеу процесі кезінде АТФ гидролизденеді. Гомологиялық бөлік табылғаннан соң RecА-ақуыз ДНҚ-ның бір тізбегін екінші тізбегімен алмастырады. Процесте АТФ гидролизденеді. Алмастыру 3/ → 5/ бағытында жүреді. Екінші бос соңы арқылы RecА-ақуыз екі дуплекс арқасында ДНҚ тізбектерін Холидей құрылымын түзе ДНҚ бойымен қозғала отырып алмастыруға қабілетті. Вектор – клондайтын ДНҚ-ның бөлшегін тасымалдайтын ДНҚ молекуласы. Вектор бұл жерде тек тасушы емес бағыттағыш деген де ұғымды білдіреді. Векторды да қолдан құрасытрады және оған мынадай талаптар қойылады: 1) вектор клетка ішіне бөтен генді алып кірген соң клеткамен бірге немесе өз алдына бөлініп көбейе алатын болуы керек, сонда ғана ол ұрпақ клеткаларға беріледі. Немесе ол клетка хромомасы (ДНҚ-сының) құрамына кіру арқылы ұрпақ клеткаға беріліп отыруы керек; 2) генетикалық белгілері болуы керек, сол белгілер бойынша оның қайтадан клетка ішіне енгенін анықтайды; 3) құрамында рестриктазалар тауып үзе алатын нуклеотидтер тізбегі болуы керек және рестриктазамен бір рет үзіліп жалғанғаннан кейін ол репликацияланатын (еселенетін) қабілетін (репликация нүктесін) жоғалтпауы тиіс; 4) құрамына кірген геннің клетка ішінде дұрысреттеліп жұмыс істеуін қамтамасыз ететін болу керек; 5) оның клетка ішіндегі көшірмесі (молекулаларының саны) жетерліктей көп болуы қажет. Қолымызда геннің өте аз мөлшері бар дедік. Геннің ондай мөлшерімен тәжірибе жасау өте қиын. Бақылау сұрақтары: Гомологиялық рекомбинация. Сайт-арнайы рекомбинация. Кроссинговердің молекулалық механизмдері. Рекомбинацияға қатысатын ферменттер. Гендк инверсия. Хиазма дегеніміз не? Рекомбинациялық желілердің маңызы. Генік конверсия және оның маңызы. Холидей құрылымының қызметі. жүктеу/скачать 0,87 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|