30
ная реакция по каталитическому расщеплению субстрата, что обнаруживает-
ся с помощью фотометра по цветной реакции.
Метод электронной микроскопии
дает возможность быстро получить
информацию о наличии вирусных частиц в растении. С помощью электрон-
ных микроскопов на ультратонких срезах пораженных частей растений мож-
но
установить форму, строение и даже размеры вирусов. Трансмиссионный
электронный микроскоп используют для серийных анализов вирусной ин-
фекции в соке растений. С помощью иммуноэлектронной микроскопии мож-
но обнаруживать вирусные частицы с наслоившимися антителами.
Метод гель-электрофореза
основан на электрофоретическом разделе-
нии предварительно очищенных нуклеиновых кислот вируса (вироида) или
его белкового компонента в полиакриламидном геле при силе тока 3 и 6 мА с
последующим окрашиванием красителем зон
соответственно нуклеиновых
кислот или белков. При сравнении высоты полученных окрашенных линий с
высотой стандартных, или маркерных, зон определяют массу (соответствен-
но и размеры) вирусных структур.
Молекулярно-генетические методы
основаны на знании строения мо-
лекулы РНК вируса или вироида. Отличаются высокой надежностью, чув-
ствительностью, быстротой. К недостаткам этих методов относятся высокая
стоимость реактивов и оборудования для проведения диагностики, а также
необходимость предварительного изучения генетических кодов патогенов.
Наиболее распространенный тест – амплификация (умножение) видо-
специфичных
последовательностей РНК при
полимеразной цепной реакции
(ПЦР), в ходе которой отдельные химически синтезированные фрагменты
РНК (праймеры), характерные только для одного вида или рода вирусов,
участвуют в ферментативном воспроизведении соответствующих участков
матричной РНК, выделенной из зараженного растения. Продукты ПЦР с по-
мощью ферментов многократно клонируют (амплифицируют)
при опреде-
ленных режимах температур в циклическом термостате, при этом исходное
число копий выбранного фрагмента РНК возрастает в миллионы раз. Затем
их обнаруживают методом гель-электрофореза или иммунофлуоресценции.
Несмотря на сложность и дороговизну, ПЦР-диагностика –
перспективный
метод, в десятки раз более чувствительный, чем иммунохимические методы.
Он позволяет выявлять и идентифицировать новые вирусы и их штаммы.
Метод ДНК-зондов –
другая модификация молекулярно-биологичес-
кого метода, также основана на принципе комплементарности видоспеци-
фичных последовательностей нуклеиновых кислот. Синтезируют зонды, ко-
торые «узнают» определенные нуклеотидные последовательности РНК виру-
са. В зависимости от выбора зондов можно дифференцировать роды, виды и
штаммы вирусов.
К
методу пересадки
растений на другой
участок прибегают для под-
тверждения или опровержения вирусной природы заболевания. Например,
для определения причин хлороза растений их можно пересадить на заведомо
благоприятную почву. Если заболевание неинфекционное, то через некото-
рое время у растений восстановится типичная зеленая окраска. При вирусном
заболевании хлороз сохранится.
Метод включений
–
один из самых простых методов, не требующих
дорогостоящего оборудования. Развитие некоторых вирусов в клетках расте-
31
ния сопровождается образованием в них скопления вирусных частиц (вклю-
чений, или кристаллов Ивановского), которые обнаруживаются с помощью
обычного светового микроскопа. Каждому виду вируса свойственна своя
форма вирусных включений, образующихся обычно в клетках волосков или
эпидермиса листьев. Например, для вируса табачной мозаики характерны иг-
ловидные и гексагональные кристаллы; для Х-вируса картофеля и вируса мо-
заики пшеницы типично образование сферических аморфных тел.
Для выявления зеленой крапчатой мозаики огурца, скручивания листь-
ев картофеля и некоторых других болезней применяют химические аналити-
ческие методы диагностики в пораженных тканях растений.
Достарыңызбен бөлісу: