Протокол № 16 Дата
1. Количественное определение активности аспартатаминотрансферазы (АсАТ) в сыворотке крови
В результате трансаминирования α-кетоглутаровой кислоты с L-аспарагиновой кислотой, происходящего под действием аспартатаминотрансферазы, образуются L-глутаминовая и щавелевоуксусная кислоты, последняя самопроизвольно декарбоксилируется с образованием пировиноградной кислоты. При добавлении 2,4-динитрофенилгидразина в щелочной среде образуется окрашенный раствор гидразона пировиноградной кислоты, интенсивность окраски которого пропорциональна активности фермента.
Ход работы:
Готовят реакционные смеси в соответствии со схемой:
Отмерить в пробирку, мл
|
Опытная проба
|
Холостая проба
|
Субстратно-буферный раствор
|
0,5
|
0,5
|
Инкубация 3 минуты при 370С
|
Стоп реагент
|
-
|
0,5
|
Сыворотка крови
|
0,1
|
0,1
|
Инкубация 30 минут при 370С
|
Стоп реагент
|
0,5
|
-
|
Инкубация 20 минут при комнатной температуре
|
0,4 N NaOH
|
5
|
5
|
Инкубация 10 минут при комнатной температуре
|
Измеряют оптическую плотность опытной пробы против холостой при 490-540 нм (светло-зеленый светофильтр) в кюветах 10 мм. Расчет активности фермента проводят по калибровочному графику.
Достарыңызбен бөлісу: |
