Сборник международной научно-практической

152 
Таблица 1 – Температурный режим реакции 
Стадия 1 
94
о
С 
2 мин. 
1 цикл 
Стадия 2 
98
о
С-58
о
С-68
о
С 
10 сек.- 30 сек.- 30 сек. 
35 циклов 
Стадия 3 
68
о
С 
7 мин. 
1 цикл 
Полноразмерную к ДНК 
IbCBF3
получали путем ПЦР из тотальной РНК, выделенной 
из сладкого картофеля, с использованием специфической пары праймеров 
IbCBF3
. 
Продукты ПЦР очищали и первоначально клонировали в T-blunt вектор (BioFACT, Daejeon, 
Корея) и секвенировали. Для генерации конструкции SWPA2::
IbCBF3
полноразмерная к 
ДНК 
IbCBF3
встраивалась в плазмиду pCAMBIA2300 под индуцибелным промотером 
SWPA2. Лигирование проводилось согласно инструкции компаний DiaStar Quick DNA 
Ligase, Korea.

Результаты исследований и их обсуждение 
Для получения исследуемых генов была выделена тотальная РНК сладкого 
картофеля при помощи реагента TRIzol по стандартному протоколу, далле была 
снтезирована кДНК с использованием готового микса TopScript™ RT DryMIX (dT18) 
(Enzynomic, Daejeon, Корея) в соответствии с инструкцией производителя. Используя базу 
данных 
NCBI 
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), 
Мичиганского 
университета 
(http://sweetpotato.plantbiology.msu.edu/) и из KRIBB (Корейского Института Биологии и 
Биотехнологии) были составлены специфические праймера для изучаемых генов.
Затем был выделен вышеуказанный ген (Рисунок 1), определена его длинна (
IbCBF3
– 786bp) и ген был клонирован в T-blunt™ вектор. Набор для клонирования T-Blunt ™ 
PCR обеспечивает жизнеспособную систему отбора, которая выращивается только во 
встроенной колонии путем автоматического вымирания самолигированного клона из-за 
гена ccdB вектора T-Blunt ™. Затем был проведен полный секвенс выделенного гена 
компанией Genotech (www.genotech.co.kr) и проведен сравнительный анализ данных с 
базами NCBI применяя программу BioEdit.
Рис
.1 – Электрофорез гена 
IbCBF3 
после ПЦР
 
Выделенный ген 
IbСBF3 
был клонирован в тело агробактериального бинарного 
вектора pCAMBIA2300 с индуцибельным промотором SWPA2. Промотор был 
предоставлен профессором С.С.Кваком (KRIBB, Корея) (рисунок 2) [10]. Наличие вставок 
было проверено методом ПЦР анализа и сиквенсом.
При разработке эффективной системы экспрессии важно выбрать подходящий 
промотор. Промотер SWPA2 индуцирует более высокие уровни экспрессии экзогенного 
гена, чем промотор 35S, мозаичного вируса цветной капусты (CaMV 35S) в ответ на 
различные стрессовые обработки, так же он был успешно применен для получения
трансгенных растений, тополь, картофель и рис [11,12,13]. Индуцируемый стрессом 
промотор SWPA2 очень подходит для создания трансгенных растений с повышенной 
устойчивостью к стрессам окружающей среды. 

153 

жүктеу/скачать 11,88 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: