Учебно-методическое пособие по общей иммунологии. Тверь 2008. Учебно-методическое пособие для практических занятий по общей иммунологии для студентов
жүктеу/скачать 0,58 Mb. Pdf көрінісі
|
Понятие об иммунной системе. Антигены
Разделение клеток иммунной системы представляет собой зачастую начальный этап получения чистой суспензии клеток и в частности лимфоцитов для дальнейшего изучения их функциональных и количественных показателей. К числу методов разделения клеток иммунной системы относятся: 1. Разделение клеток при помощи адгезии (разделение клеток на стеклянных гранулах, фракционирование клеток на нейлоновых волокнах). 2. Разделение на аффинных колонках. 3. Разделение клеток методом цитолиза. 4. Разделение клеток при помощи розеткообразования. 5. Разделение клеток в градиенте плотности . 6. Разделение больших объемов крови с помощью сепараторов крови. РАЗДЕЛЕНИЕ КЛЕТОК В ГРАДИЕНТЕ ПЛОТНОСТИ Принцип данного метода - различная скорость оседания иммунокомпетентных клеток в градиенте плотности, в зависимости от их удельной плотности. Для выделения лимфоцитов используют смесь, состоящую из 12 частей 9% фиколла и 5 частей 33,9% верографина, имеющую плотность 1,077. Цельную кровь, нанесенную на эту смесь, центрифугируют, и клетки с различной удельной плотностью разделяются. Лимфоциты и моноциты остаются на градиенте плотности, так как имеют плотность 1,077, а эритроциты и гранулоциты оседают на дно пробирки. Соотношение объемов градиента и разделяемой суспензии должно быть 1:2—1:5. Интерфазный слой отсасывают пастеровской пипеткой, добавляют физиологическую среду и отмывают выделенные мононуклеары (3 раза). Гранулоциты получают из осадка, отделяя эритроциты или лизируя их 0,083% раствором хлористого аммония. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК Жизнеспособность клеток определяют после добавления 0,1% раствора трипанового синего . Жизнеспособные клетки не должны окрашив аться . Погибшие окрашиваются красителем. В норме 95% клеток и более не должно окрашиваться, т.е. должны быть жизнеспособными. ПОДСЧЕТ КОЛИЧЕСТВА ЛЕЙКОЦИТОВ В пробирку помещают 0,4 мл 3% раствора уксусной кислоты, подкрашенной метеленовой синью, а затем пипеткой от гемометра Сали набирают 0,02 мл крови и выдувают в пробирку. Заполняют счетную камеру Горяева. Подсчет проводят в 25 больших квадратах, что составляет 100 маленьких квадратов. Лейкоциты считают при малом увеличении (окуляр х15,объектив х20). Формула для подсчета количества лейкоцитов в 1 мкл крови: Х = (К х 250 х 20) : 100, где Х - искомое число лейкоцитов в 1 мкл крови, К - число лейкоцитов в 100 маленьких квадратах. жүктеу/скачать 0,58 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|