Қазақстан республикасы ауыл

260
вый порошок. Для получения ацетонового порошка бактериальные клетки заливали аце-
тоном в соотношении 1:3 и инкубировали на шейкере при 37 С 1.5 ч, осаждали полу-
ченную взвесь центрифугированием и удаляли ацетон. Заливку ацетоном, инкубацию, 
центрифугирование и удаление ацетона повторяли двукратно. Обработанную ацетоном 
бактериальную массу оставляли при комнатной температуре с доступом воздуха до пол-
ного высушивания. Антигенный препараты из ацетонового порошка B. abortus получали 
обработкой бактериальных клеток 10% диметилсульфоксидом (ДМСО). Обработанные 
ацетоном микробные клетки заливали раствором ДМСО подогретым до 37 С из расчета 
1 г бакмассы на 6 мл ДМСО и встряхивали в течение 30-40 мин при 37 С, после чего 
микробные клетки отделяли центрифугированием (5000 g, 20 мин, 4 С) и диализовали 
против 0.01 М карбонатно-бикарбонатного буфера (рН 9.6) в течение 2-х суток с пяти-
кратной сменой буфера. После проведения диализа антигены концентрировали с помо-
щью фильтрационной установки Amicon и мембран PLGC, разливали на аликвоты по 300 
мкл и лиофильно высушивали. Хроматографическую очистку проводили на колонке 1×5 
см с Toyopearl DEAE-650 на хроматографе NGC Quest 10. Носитель уравновешивали 0.05 
М Трис-HCl, pH 7.5. Уравновешенный образец (100 мкл), содержащий 240 мкг белка, на-
носили на колонку. Элюаты собирали в виде фракций, используя ступенчатый градиент 
от 0 до 0.5 М NaCl в H2O. Значения оптической плотности элюатов контролировали на 
длине волны 280 нм с помощью спектрофотометра Spectronic-21.
На следующем этапе проводили конъюгацию выделенных антигенов бруцелл с НЧЗ. 
Перед конъюгацией определяли «золотое число» (минимальное количество антигена, за-
щищающее золь от солевой агрегации). Для этого в 96-луночном микротитровальном 
планшете двукратно по 20 мкл титровали водный раствор антигена. В каждую лунку 
добавляли по 200 мкл 15-нм НЧЗ (А520=1.0) и по 20 мкл 1.7 М NaCl и определяли мини-
мальную стабилизирующую концентрацию. При получении конъюгата НЧЗ со антигена-
ми бруцелл «золотое число» составило 25 мг/мл, со стафилококковым белком А – 8 мг/
мл. Конъюгацию проводили простым смешением реагентов без использования сшиваю-
щих агентов, используя концентрацию антигена на 20% превышающую золотое число.
Полученными конъюгатами проводили иммунизацию белых мышей линии BALB/c 
массой 18-20 г. Было сформировано 5 групп животных по 6 голов в каждой группе. Пре-
парат вводили внутрибрюшинно двукратно с интервалом в 10 дней, эвтаназию животных 
проводили через 10 дней после последней инъекции. 1-й (контрольной) группе вводи-
ли 0.5 мл забуференного физиологического раствора (ЗФР); 2-й группе – 0.5 мл НЧЗ 
(А520=1.0); 3-й группе – антиген в дозе 25 мкг; 4-й группе – конъюгат антигена (25 мкг) 
с НЧЗ; 5-й группе – антиген (25 мкг), эмульгированный 1:1 в полном адъюванте Фрейнда 
(ПАФ). После завершение иммунизации собирали сыворотку крови для определения ти-
тра и концентрации интерлейкинов, а также проводили выделение перитонеальных ма-
крофагов и клеток селезенки для изучения дыхательной и пролиферативной активности.
Титры полученных по различным схемам антител в сыворотке крови определяли с 
помощью твердофазного иммуноферментного анализа [8], используя ДМСО-антиген в 
качестве иммобилизованного антигена, с применением в качестве вторичных антител ме-
ченных пероксидазой хрена антитела к IgG мыши. Результаты реакции регистрировали 
на микропланшетном спектрофотометре Plate Screen. Наиболее высоким оказался титр у 
мышей, иммунизированных антигеном, эмульгированным в ПАФ – 1:10240. Сам антиген 
оказался низкоиммуногеным (1:640).
Выделение и культивирование перитонеальных макрофагов проводили по стандарт-
ному методу [9]. Спленоциты выделяли по следующей методике [10]: селезенку перети-
рали в ступке с раствором Хенкса и пропускали через нейлоновый фильтр. Мононукле-
арные клетки выделяли на градиенте фикол-верографина, лизировали эритроциты 0.83% 
хлористым аммонием. Определение дыхательной активности проводили по способности 
клеток восстанавливать нитротетразолевый синий бромид до формазана по общепри-
нятому методу [11]. Измерение количества восстановленного формазана проводили на 

261
спектрофотометре Genesys 10S UV Vis при длине волны 490 нм. В качестве контроля 
использовали формазан в концентрациях 0.002; 0.02; 0.2 и 2 мг/мл; с этими концентраци-
ями строили калибровочную кривую. При анализе полученных данных можно отметить, 
что дыхательная активность перитонеальных макрофагов мышей повышается при имму-
низации конъюгатом антиген+НЧЗ на 67%, антиген+ПАФ на 80%, нативным антигеном 
на 35% по сравнению с контрольной группой (контроль – ЗФР).
Для оценки пролиферативной функции лимфоцитов мы использовали антигенную 
стимуляцию спленоцитов, выделенных от иммунизированных мышей in vitro. Данный 
метод позволяет составить представление о выраженности специфической сенсибили-
зации организма. При анализе полученных данных можно отметить, что пролифератив-
ная активность мононуклеарных клеток мышей повышается в среднем при иммунизации 
конъюгатом антиген+НЧЗ в 2.7 раза, антиген+ПАФ в 2.6 раза, нативным антигеном в 1.9 
раза по сравнению с контрольной группой.
Специфичность полученных антител анализировали с помощью иммуноблоттинга. 
После проведения электрофореза образцы белка переносили с помощью полусухого 
блоттера Ultraphor 2217 на поливинилиденфторидную мембрану «Western S». Мембра-
ну инкубировали в течение 1 ч в поликлональных мышиных антителах, полученных от 
мышей, иммунизированных конъюгатом антиген+НЧЗ. После чего мембрану промывали 
и инкубировали с конъюгатом стафилококкового белка А с НЧЗ (А520=1.0). Выявлена 1 
иммуногенная полоса в районе 35 кДа.
Чувствительность поликлональных антител, полученных от мышей, иммунизирован-
ных конъюгатом антиген+НЧЗ, проверяли в дот-иммуноанализе [12]. В качестве образ-
цов на нитроцеллюлозную мембрану в виде серии точек наносили антиген с начальной 
концентрации 1 мг/мл. Затем блокировали мембрану с нанесенным на нее антитегном в 
течение 1 ч 2% сухим молоком, разведенным в 0.01 М ЗФР, pH 7.2. После чего мембрану 
погружали в раствор специфичных антител и проводили инкубацию на шейкере в тече-
ние одного часа при комнатной температуре. Затем мембрану трехкратно отмывали от 
неспецифически связавшихся антител и инкубировали в растворе конъюгата НЧЗ со ста-
филококковым белком А (А520=0.5). Через 5-60 мин, конъюгат связывался с комплексом 
антитегн-антитело, что можно было визуально наблюдать в виде серии красных пятен. 
Минимально выявляемое количество антигена составило ~0.5 пг (двенадцатое разведе-
ние).
Определение концентрации интерлейкинов в сыворотке крови проводили с исполь-
зованием наборов реагентов для ИФА IL-1β, IL-6 и INF-γ. При анализе полученных дан-
ных можно отметить, что наиболее интенсивный рост наблюдался в группе, иммуни-
зированной антиген+ПАФ уровень интерферона в данной группе, составил 272±24 пг/
мл. При иммунизации антиген+НЧЗ уровень интерферона составил 211±63 пг/мл. Им-
мунизация нативным антигеном также показала небольшой рост концентрации интерфе-
рона, он составил 116±33 пг/мл. Уровень интерлейкина-бета в группе, иммунизирован-
ной антиген+ПАФ, составил 138±21 пг/мл, в группе, иммунизированной антиген+НЧЗ 
– 160±7 пг/мл, в группе, иммунизированной нативным антигеном – 234±21 пг/мл, со-
ответственно. Уровень интерлейкина-6 в группе, иммунизированной антиген+ПАФ, со-
ставил 35±2 пг/мл, в группе, иммунизированной антиген+НЧЗ – 33±4 пг/мл, в группе, 
иммунизированной нативным антигеном – 24±6 пг/мл, соответственно.
Полученные результаты по иммуногенности комплекса антиген+НЧЗ предполагается 
в дальнейшем использовать для исследования протективного эффекта конъюгатов НЧЗ 
с антигенами 
B. abortu
s при вакцинации животных по сравнению с коммерческой вак-
циной. Полученные антитела к бруцеллезным антигенам предполагается использовать 
при разработке тест-систем для диагностики бруцеллеза с применением твердофазных 
методов иммуноанализа в лабораторных и полевых условиях.
Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 19-
14-00077).

262

жүктеу/скачать 5,46 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: