Б. Б. Ерниязова
жүктеу/скачать 1,31 Mb. Pdf көрінісі
|
ГЕНДІК ИНЖЕНЕРИЯ
| 6.6 Ген скринингі
Ген скринингі туралы түсінік. Қажет генді барлық бактериялар массасынан алу үшін оларды қатты қоректік ортаға егеді, мұнда бактерияның әрбір жеке жасуша сы жеке ұрпақ береді, яғни бактериялық шоғыр түзіледі. Енді гендер жинағын, яғни әртүрлі клондар арасынан бізге қажет генді табу қерек. Бұл үдеріс скрининг деп аталады. Гендер жинағы аз болған сайын одан қажет генді табу оңай. Комплементарлы ДНҚ клонын кӛбейту әдісі гендер жинағы мӛлшерін азайтуға әкеледі, дегенмен мұның ӛзінде де қажет генді табу үшін арнайы әдістер қолданылады. Кең тараған әдістің бірі шоғырларды гибридизациялау деп аталады. Ол үшін Петри шынысындағы негативтік шоғырларға (рекДНҚ-сы бар бактериялар) нитроцеллюлозалы сүзгіні беттестіреді, бұның нәтижесінде ДНҚ молекулалары сүзгіге жабысады. Сүзгінің газонга сәйкес орны үлкен дәлдікпен мұқият белгіленуі қажет, мысалы, сүзгі мен оның астындағы газоны бар агарды бірнеше жерден инемен шаншиды. Бұдан кейін сүзгіні тез арада 0,5 М NаОН-пен ӛңдейді, онан соң бейтараптайды. Бұның нәтижесінде қос тізбекті ДНҚ молекулалары денатурацияланып жеке тізбектерге ажырап, интроцеллюлозамен байланысады. ДНҚ молекуласын нитроцеллюлозалы сүзгіде берік бекіту үшін оларды 80°С температурада қыздырады. Ген скринингісінің кезеңдері. Ген скринингісінің келесі жауапты кезеңі сүзгіні радиоактивті зондпен ӛңдеу. Зонд (сүңгі) дегеніміз іздеп жатқан ген бӛлігінің азоттық негіздеріне комплементарлы кішігірім ДНҚ немесе РНҚ тізбегі. Сүзгі әр уақытта радиоактивті изотоппен белгіленеді. Сүңгіні (зонд) синтездеу үшін геннің немесе нәруыздың ең болмағанда кішігірім бӛлігінің нуклеотидтер тізбегі белгілі болуы керек. Олардың амин 60 қышқылдар тізбегі бойынша және генетикалық кодтың кӛмегімен геннің бӛлігін кодтайтын нуклеотидтор тізбегін оңай алуға болады. Алайда, кодтың туылмалы (синонимділігін) екендігін ескеру қажет, сондықтан нәруыздың белгілі тізбегінен метионин және триптофан амин қышқылдары (олардың бірден ғана кодондары бар) болатын бӛліктерінен жасанды олигонуклеотид синтезделеді. Генетикалық кодтың туылмалығына байланысты ерекше жалғыз сүңгі синтездеу мүмкін болмаса (мысалы, гендегі сер-сер-про-ала амин қышқылдар қатары әртүрлі оқылуы мүмкін — АГЦАГАГГАЦГА немесе АГТТЦГГГГЦГЦ) жасанды сүңгілер сериясын немесе табиғи синтездеу қажет. Табиғи сүңгі ретінде қажет геннің экспрессиясы қарқынды жүретін жасушадан әртүрлі жолдар арқылы алынған РНҚ-ны пайдалануға болады. Кӛпшілік жағдайда осындай РНҚ- дан кері транскрипция процесі арқылы алынған олигонуклеотидтік кДНҚ сүңгі ретінде жиі қолдану алды. Сүңгі алынғаннан кейін рекомбинантты векторды талдауға кіріседі. Гендер жинағын бүкіл геномдық немесе комплементарлық ДНҚ-ның) ДНҚ (РНҚ) — сүңгімен тексереді. Сүңгі тек ӛзіне комплементарлы генмен ғана гибридтеледі (байланысады). Бұның негізінде ДНҚ-РНҚ-сүңгі гибридтерінің құрылуы жатады. Сондықтан сүңгі бір тізбекті болуы және гибридтелу қолайлы жағдайда ӛтуі қажет: жоғары температура (бірақ тым кӛтеріңкі емес, ӛйткені түзілген гибридтер қайтадан ыдырап кетеді), ұзақ уақыт (сүңгі ӛзінің ДНҚ-сын тауып үлгеруі үшін). Гибридтеу процедурасы аяқталғаннан кейін сүзгіні жуып артық сүңгілерден тазалайды, ӛйткені сүзгіге жабысқан артық сүңгілер күшті радиоактивтік орта түзіп, гибридтелу нәтижесін бұзады. Енді қажет ген бар ДНҚ тізбегі сүңгімен байланысып, радиоактивті изотоп (фосфор немесе иод) түрінде таңбаланады. Оның орнын табу салыстырмалы қарапайым: сүзгіні кәдімгі рентген фотопленкасының үстіне басады, қажет экспозициядан соң (оның уақыты радиоактивтіліктің күшімен анықталады) фотопленканы шығарады. Сүзгідегі радиоактивті ДНҚ бар орын фотопленкада кішігірім қара дақ түрінде кӛрінеді. Осындай фотопленкада радиоактивті изотоппен таңбаланған генді жарықта түсірілген ізі арқылы табу әдісі радио- аутография деп аталады. Сүзгідегі дақтың орнына қарай отырып, газоннан қажет рекДНҚ енген негативтік шоғырды табуға болады. жүктеу/скачать 1,31 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|