Б. Б. Ерниязова
ДНҚ молекулаларын жасушаға енгізу
жүктеу/скачать 1,31 Mb. Pdf көрінісі
|
ГЕНДІК ИНЖЕНЕРИЯ
| 6.4 ДНҚ молекулаларын жасушаға енгізу
Гибридті молекулаларды жасушаға енгізу тәсілі векторға байланысты. Егер вектор ретінде плазмида қолданылса, онда енгізу трансформация типімен, егер фаг қолданылса, онда трансфекция (жасушаның фаг ДНҚ-сы арқылы инфекциялануы) типімен ӛтеді. Трансформация мен трансфекцияның жалпы жолы бактерия жасушасын кальций тұздарымен (СаСl 2 ) ӛңдегенде, олардың мембраналарының ДНҚ-ны ӛткізе алатындығына негізделеді. Экзогенді (бӛтен) ДНҚ-ның жасушаға ену тиімділігі тӛмен. Алдын ала СаСl 2 -мен ӛңделген жасушаға, мысалы, 1 мкг рВR322 плазмидасын қосса, онда әрбір 104-105 плазмиданың біреуі ғана жасушаның ішіне енеді, яғни бактериялардың азғантай бӛлігі ғана трансформациялана алады. Оларды басқалардан бӛлу бактерия клондарын алу процесінде іске асады. Жаңа ген материалының енгізілуі трансформация деп аталады. Трансформация табиғатта кездеседі. Идентификация және жасушаларды іріктеу жүргізіледі. Трансформацияланған жасушалар іріктелінеді. Ол үшін идентификация жасалады және соңғы сатысы арнайы нәруыз синтезделуі, іздестіріп отырған геннің клондалғанын дәлелдейді. Ең алдымен трансфекция немесе трансформацияға компетентті жасушалардың жасуша қабықшасын ферменттік гидролиздеу арқылы бұзады. Ол үшін әртүрлі ферменттер (мысалы, лизоцим) немесе ферменттердің қоспасы, жүзім ұлуының ас қорыту сӛлі қолданылады. Жасушаны ферменттік ӛңдеу кезінде оларды изотоникалық ерітіндіге салады. Олардың құрамында 0,2М сахароза, 1М сорбит, 0,6М HCl. 57 Бұлардың изотоникалық деп аталу себебі, жасуша цитоплазмасы сұйықтығының осмостық қысымы қандай болса, сыртқы ерітіндісінің де осмостық қысымы сондай. Мұндай жағдайда сыртқы қабығынан ажыраған жасушалар шар тәрізді пішінге ие болады және осмостық қысымның әсерінен жарылып кетпейді (гипотоникалық ерітіндіде жарылады). Егер ферменттік гидролизден кейін плазмалық мембрана жасуша қабықшасының қалдықтары қалып қалса немесе Грамм теріс бактерияларға тән сыртқы мембранасы сақталса, мұндай жасушаларды сферопласт деп атайды. Протопласттар сияқты олар да осмостық қысымға сезімтал және изотоникалық ерітіндіде шар тәрізді пішінге ие болады. 1982 жылы Т.Вонг және Е.Нейман ӛсірілетін жасушаларға ДНҚ- ны енгізу үшін электропорация әдісін қолданған. Кейінгі жылдары бұл әдіс одан да жақсы жетілдірілді. Нәтижесінде бұл әдісті эукариотты да, прокариотты да жасушаларға қолдану мүмкін болды. Бұл әдістің мәнісі жоғарғы кернеуліктегі 1-15 кВ/ см электр ӛрісін 5-20 мс қысқа мерзімде жасуша мембранасынан ӛткізеді, яғни поралар пайда болады және бұл поралардың мӛлшері мен ӛмір сүру уақыты ДНҚ молекуласының осмостық күштер әсері нәтижесінде сыртқы ортадан жасушаға еніп үлгеруіне мүмкіндік береді және бұл кезде жасушаның кӛлемі ұлғаяды. Электр ӛрісінің кернеуін және оның әсер ету ұзақтығын, трансформацияланатын ДНҚ концентрациясын, реципиент жасушалар мӛлшерін әр жүйе үшін тәжірибе жүзінде таңдап алады. Яғни, тірі қалған жасушалардың ДНҚ-ны сіңіру жиілігі жоғары болуы керек. Электропорация - ДНҚ молекуласын жасушаға енгізудің қарапайым тиімді әдісі. Оптималды жағдайда электропорация арқылы алынған трансформанттар саны тірі қалған жасушалардың 80% - ын құрауы керек. Сол жағдайда ең тиімді болып саналады. Электропорациялау эффектісі қос липидтік мембрананың радиусының қисықтығына тәуелді. Сондықтан неғұрлым тиімді жүргізу үшін ұсақ бактериялар жасушаларына электр ӛрісінің жоғарғы кернеулігі қажет болады (10 кВ/см және одан да кӛп). Ал ірі жануар, ӛсімдік жасушаларына 1-2 кВ/см ғана керек. жүктеу/скачать 1,31 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|