Б. Б. Ерниязова
жүктеу/скачать 1,31 Mb. Pdf көрінісі
|
ГЕНДІК ИНЖЕНЕРИЯ
- Бұл бет үшін навигация:
- 6 In vitro ДНҚ молекулаларын құрастыру әдістері Дәріс жоспары
- 6.1 Коннекторлық әдіс
| СӚЖ тапсырмалары:
1. Плазмидалық векторлардың түрлері. 2. Фаг векторлары – артықшылығы мен кемшіліктері. 3. Тікелей сұрыптау векторлары. 6 In vitro ДНҚ молекулаларын құрастыру әдістері Дәріс жоспары: 6.1 Коннекторлық әдіс 6.2 Рестриктаза-лигазалық әдіс 6.3 ДНҚ векторлық молекулалары 6.4 ДНҚ молекулаларын жасушаға енгізу 6.5 Ген клонын кӛбейту 6.6 Ген скринингі 6.1 Коннекторлық әдіс рекДНҚ құрастырудың әдістері. Рекомбинантты ДНҚ құрастырудың ең кең таралған әдісі рестриктазаларды қолдануға сүйенеді. Ол «жабысқақ» ұштар әдісі деп аталады. Бұл әдісте рекомбинантты ДНҚ құрастыру Коэн- Бойер үлгісі бойынша іске асады. Ген де (бӛтен ДНҚ үзіндісі де) және векторда бір рестрикциялық ферменттің кӛмегімен үзіледі, нәтижесінде олардың ұштары бір-біріне комплементарлы, яғни «жабысқақ» болғандықтан гибридтік (немесе химерлі) ДНҚ молекуласына ДНҚ лигаза ферментінің кӛмегімен оңай бірігеді. «жабысқақ» ұштар әдісі ӛзі танитын ДНҚ бӛлігін симметрия ӛсінен біршама қашықтықта үзітіп рестриктазаларға сүйенеді. Рекомбинантты ДНҚ-ны «жабысқақ» ұштар әдісі бойынша құрастырудың жақсы жақтары және кемшіліктері бар. Алынған гибридтік ДНҚ тізбегінде рестриктаза тани алатын бӛліктердің қалпына келуі әдістің жақсы жағын сипаттайды. Бұл бӛтен ДНҚ фрагментін осы рестриктазаның әсерімен салыстырмалы оңай бӛліп алуға мүмкіндік береді. Ал, рестриктаза арқылы алынған барлық тізбектердің – «жабысқақ» ұштардың бір-бірімен (гомологты тізбектер) реассоцияланып (қайтадан бірігуі) кетуі әдістің кемшілігін кӛрсетеді. Осының нәтижесінде векторлық молекулалардың бірқатар бӛлігі ендірмелермен емес, ӛз ұштарымен тікелей әрекеттесуі арқасында қалпына келеді, ал басқа векторлар болса бірнеше біріккен бӛтен ДНҚ молекулаларынан құралған ендірмелермен қосылып кетуі мүмкін. Сондықтан бір ғана ендірмесі бар гибридтік векторларды іріктеу жұмысын асыру керек. 50 Бұдан басқа бұл әдістің күрделілігі бар: рестриктаза танитын нүктелер эксперимент үшін ыңғайлы бӛлікте орналаспауы мүмкін, мысалы, олар қажет геннің ішіне локализацияланады. ДНҚ-ның кез келген ұшын плазмидамен рекомбинациялау үшін пайдалануға мүмкіндік туғызатын басқа әдістер де бар. Рекомбинацияланған ДНҚ-мен жасалатын тәжірибелер келесідей сызба бойынша іске асырылады (20-сурет). 20-сурет - Рекомбинантты ДНҚ клондану сызбасы Рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастырудың ыңғайлы әдісі — «доғал» ұштарды жалғау (тігу). Оның, негізіне Т4 фагынан бӛлінген ДНҚ- лигаза ферментінің «доғал» ұшты екі ДНҚ молекуласын жалғау қабілеттілігі жатады. Бұл әдістің артықшылығы оның кез келген соңғы нуклеотидтер тізбегін жалғай алатындығынан тұрады. Егер белгілі екі 51 тізбекті араларына ендірмеусіз жалғау керек болса, онда бұл әдісті пайдалану ӛте ыңғайлы. Әдетте, модификацияланбаған ДНҚ молекуласын (метилаза ферментімен метилденбеген) бактерия жасушасының рестрикциялық ферменттері ыдыратып жіберетінін біз білеміз. Ал, жасушаға рекомбинантты ДНҚ молекуласының кӛп мӛлшерін енгізсе, онда оның рестриктазалары оларды ыдыратып үлгере алмайды. Бактериялық рестриктазалар кесіп үлгірмеген рекДНҚ-ның біраз бӛлігі рестриктаза танитын орындарда метилденіп — модификацияланып кетеді. Ғалымдар генетикалық инженерия тәжірибелерінде рестрикциялық ферменттері жоқ бактериялық жасушаларды жиі қолданады. Мұндай рестрикцияланбайтын жасушаларда әдетте модификациялаушы ферменттер де жоқ болады. 1972 жылы Пол Найм Берг ӛзінің әріптестерімен бірге in vitro жағдайында SV40 вирусының ДНҚ-сымен фагтың advgal ДНҚ-сын гибридтеді. Бұл әдіс коннекторлық деп аталды (21-сурет). 21-сурет - Коннекторлық әдіс сызбасы Бұл әдіс мәнісі рекомбинацияланатын ДНҚ фрагментінің біреуінің 3ʹ ұшына дезоксирибозануклеотидилтрансфераза кӛмегімен бір тізбекті олиго-dA сегменттерді жалғайды. Келесі ферменттердің ұшына сондай ұзындықтағы олиго-дезокситимидилді жалғайды. Олардың орналасуының нәтижесінде сақиналы құрылымдер түзіледі. Олиго-dA және олиго-dT арасында комплементарлы сутектік байланыс қалыптасады. Гибридті молекуланың бір тізбекті болып қалып қойған жерлерін ішек таяқшасының ДНҚ полимераза 1 ферментінің кӛмегімен толықтырады және тізбектің ковалентті байланысуын лигазалық рекомбинация арқылы іске асырады. 52 Бұл әдістің кемшіліктері бар гибридтік молекулалардан қосылған фрагментті бӛліп алу қиынға түседі. Кейбір жағдайда олиго-dA олиго-dT бірізділіктерін таңдамалы денатурациялауға жағдай жасап, түзілген тізбектерді эндонуклеаза S1 кӛмегімен үзеді. Рестриктаза Pst І кӛмегімен жасалатын ДНҚ фрагменттерінің рекомбинациясы кезінде осы рестриктаза танитын бӛліктер қайта қалпына келеді, сондықтан гибридті молекуладан осы рестриктазаның кӛмегімен үзіп алуға мүмкіндік туады (22-сурет). 22-сурет - Вектор молекуласын Pstl – учаскесі бойынша ДНҚ фрагменттерін коннекторлық әдіспен клондау сызбасы Гомополимерлі ұштар әдісінде немесе коннекторлық симметрия ӛсімен үзетін рестриктаза арқылы алынған ДНҚ фрагменттерінің «доғал» ұштарына (шығыңқы бір тізбекті бӛлігі жоқ) терминалдық трансфераза ферментінің кӛмегімен гомонуклеотидтер, мысалы ДНҚ-ның 3'— ұштарына поли (Т) немесе поли (Ц), ал векторлық ДНҚ-ның 3'— ұштарына поли (А) немесе поли (Г) жалғанады. Гомополимерлі ұштардан құралған ДНҚ фрагменттерін (бӛтен ДНҚ және вектор) бір ортаға қосса, олар комплементарлы жұп негіздерін түзіп, оңай бір молекулаға бірігеді. Бұл әдетте жасанды комплементарлы олиго-dA олиго-dT немесе олиго-dГ олиго-dЦ. Бұл әдістің кӛмегімен жеткілікті ұзын ӛзара комплементарлы бір тізбекті ұштар қалыптасатындықтан гибридті 53 молекулалардың түзілуі тиімді жүреді. Сондықтан мРНҚ-дан ДНҚ кӛшірмелерін клондау кезінде әдетте коннекторлық әдісті қолданады Бірақ үзілген қажетті бірізділіктермен қатар бұл ферментте қосымша ұштары болады, яғни dГ, dЦ. жүктеу/скачать 1,31 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|