Дәріс №13 Қарастырылатын сұрақтар

жүктеу/скачать 3,06 Mb.

бет	2/4
Дата	20.12.2023
өлшемі	3,06 Mb.
	#198201

1 2 3 4

Байланысты:
ДНК секвенирование (2)

ДНҚ-матрица:
Бастапқы материал ретінде көбейту керек ДНҚ-ның аз мөлшері қолданылады.
Нуклеотидтер (dNTR):
Дезоксирибонуклеотидтердің (dNTP) төрт түрі қосылады — аденин (A), тимин (T), цитозин (C) және гуанин (G). Бұл нуклеотидтер жаңа ДНҚ тізбегінің құрылыс материалы ретінде қызмет етеді.
Олигонуклеотидтер-праймерлер:
Жаңа ДНҚ тізбегінің синтезінің бастамашысы ретінде әрекет ететін праймерлер деп аталатын қысқа бір тізбекті олигонуклеотидтер қосылады.
Ыстыққа төзімді (термостабильді) полимераза:
Реакцияға taq-полимераза сияқты термостабильді полимераза қосылады. Бұл фермент жоғары температураға төтеп бере алады, бұл бірнеше қыздыру және салқындату циклдарын өткізуге мүмкіндік береді.
Жылыту және салқындату циклдары:
Реакция жылыту және салқындату циклдарын жүзеге асыратын термиялық циклде жүзеге асырылады.
Денатурация: жоғары температурада (әдетте шамамен 94-98°C) екі ДНҚ тізбегі бөлініп, екі Бір тізбекті үлгіні құрайды.
Күйдіру/отжиг (аннелизация): Температура төмендейді (әдетте 50-65°C дейін), бұл праймерлерге әрбір бір тізбекті матрицамен байланысуға мүмкіндік береді.
Элонгация: температура көтерілген кезде (әдетте шамамен 72°C) термостабильді полимераза матрица мен қосылған нуклеотидтерді пайдаланып жаңа ДНҚ тізбегін синтездейді.
Циклдарды қайталау:
Бұл үш қадам бірнеше рет қайталанады (әдетте 20-40 цикл), бұл ДНҚ мөлшерінің экспоненциалды өсуіне әкеледі.
Реакцияның аяқталуы:
Циклдар аяқталғаннан кейін реакция аяқталады және алынған амплификацияланған ДНҚ қосымша зерттеулер үшін пайдаланылуы мүмкін.
ДНҚ амплификация молекулярлық диагностика, генетикалық зерттеулер, гендік клондау, секвенирлеу, және биологиялық зерттеулердің көптеген басқа салаларын қоса алғанда, кең ауқымды қолдануға ие.
Полимеразды тізбекті реакция (ПТР) — бұл белгілі бір ДНҚ тізбегінің көптеген көшірмелерін алуға мүмкіндік беретін ДНҚ-ны күшейту (амплификация) әдісі. Бұл әдісті 1983 жылы Кэри Мюллис жасаған және содан бері молекулалық биология мен генетиканың негізгі құралдарының біріне айналды.
ПТР негізгі сатылары:

Денатурация
Отжиг
Элонгация

Зерттеудің зертханалық диагностикада белсенді қолданылатын бірнеше варианттары бар:

Кері транскрипциямен (RT-ПТР,RT-PCR). Әдістің бұл түрі рибонуклеин қышқылының белгілі бір фрагментін күшейту болып табылады. Яғни, бір жасушалы РНҚ кері транскрипция реакциясы арқылы комплементарлы ДНҚ-ға айналады. Бұл РНҚ матрицасынан белгілі тізбекті оқшаулауға және анықтауға мүмкіндік береді.
Нақты уақыттағы ПТР (RT-ПТР). Бұл сандық зерттеу әдісі, өйткені ол нуклеотидтер тізбегін анықтауға және оның көшірмелерінің санын өлшеуге мүмкіндік береді. Яғни, осының арқасында бастапқы ДНҚ немесе РНҚ үлгілерінің санын түсінуге болады.
Нақты уақыттағы иммундық ПТР. ПТР нуклеин қышқылдарының болуын анықтауға мүмкіндік береді, бірақ көбінесе ферменттерді, гормондарды, токсиндерді, антиденелерді және т.б. анықтау қажет. Сондықтан екі әдісті біріктіру қажет болды – ПТР және ИФА, нәтижесінде бұл әдіс пайда болды.

Сондай-ақ, белгілі бір жағдайларда қолданылатын ПТР басқа түрлері бар:

Ыстық стартпен ПТР. Бұл жағдайда реакцияны бастамас бұрын құрылғыға оның белсенділігін блоктайтын антиденелермен бірге полимераза қосылады.
Сатылы ПТР. Бұл жағдайда реакцияның алғашқы циклдары жоғары температурада жүзеге асырылады, біртіндеп оңтайлы деңгейге дейін төмендейді.
Суық ПТР. Бұл әртүрлілік геннің бір нуклеотидті мутациясын анықтау қажет болған жағдайда қолданылады.
Мультиплексті ПТР. Зерттеудің бұл нұсқасы бірден бірнеше нуклеотидтер тізбегін анықтауға мүмкіндік береді. Алынған ДНҚ матрица бар бір пробиркаға праймерлердің тұтас жиынтығы қосылады, нәтижесінде бірнеше фрагменттер бір уақытта күшейтіледі.
Асимметриялық ПТР. Бұл типтегі Реакция ДНҚ тізбектерінің біреуі ғана учаскенің күшейтілген көшірмесін алу қажет болған жағдайда жүзеге асырылады.
Инверсиясы ПТР. ДНҚ-ның бір бөлігі белгілі болған жағдайларда қолданылады.
Ұзын фрагменттердің ПТР. Кейбір жағдайларда өте ұзын фрагменттерді күшейту қажет, 5-тен астам нуклеотидтер. Бұл жағдайда екі полимеразаны қамтитын ұзын фрагменттердің жеке ПТР әдісі қолданылады.

Әдебиеттердегі нуклеин қышқылдарының нуклеотидтер тізбегінің реттілігін анықтау әдістері әдетте секвенирлеу әдістері деп аталады. Өткен ғасырдың 50-ші жылдарында полипептидтік тізбектегі аминқышқылдарының тізбегін анықтау әдістері жасалды. Ал 60-жылдардың аяғында Ф. Сангер РНҚ-полимераза көмегімен ДНҚ матрицасынан алынған РНҚ-ны секвенирлеу әдісін жасады.
ДНҚ секвенирлеудің бірнеше әдістері бар, олардың әрқайсысының өзіндік ерекшеліктері, артықшылықтары мен шектеулері бар. Бірнеше негізгі әдістер:

Сэнгер әдісі
Максам-Гилберт әдісі
«Жаңа заман» секвенирлеу әдістері - next-generation sequencing (NGS)

Пиросеквенирлеу (454 Pyrosequencing)
Флуоресцентті таңбаланған нуклеотидтерді пайдалана отырып, молекулалық кластерлерде секвенирлеу технологиясы
Циклдік лигазды секвенирлеу технологиясы
Иондық жартылай өткізгішті секвенирлеу (Ion Torrent)
Бір молекулалы секвенирлеу (SMRT)

жүктеу/скачать 3,06 Mb.

Достарыңызбен бөлісу:

1 2 3 4