Б. Б. Ерниязова

35 
ұшы белгісіз себептермен шпилькалы кұрылым түзеді, осы құрылым 
екінші ДНҚ-ның синтезін инициациялай алады. ДНҚ-ның екінші тізбегі 
синтезделіп болғаннан кейін, оның алғашқы кДНҚ-ымен қосылған бӛлігі 
(шпилькалы) нуклеаза S1 ферментінің әсері арқылы ажырайды, 
нәтижесінде қос тізбекгі ген алынады, оңы қос тізбекті комплементарлы 
ДНҚ (кДНҚ) деп атайды. РНҚ жіпшелері сілтінің әсерімен гидролизденеді, 
ал олигонуклеотидтер аталған нуклеазаның әсерімен ыдырайды. 
Кері транскриптаза ферменті арқылы синтезделген гендерді бактерия 
жасушасына енгізбестен бұрын, оларға реттеуші элементтер жалғайды. 
Прокариоттарда сплайсинг ӛтпейтінін ескерсек, онда генді ферменттік 
жолмен синтездеу үшін матрица ретінде гяРНҚ-ны емес, жетілген мРНҚ 
пайдалану керек. 
Гомологты емес ДНҚ молекуласының in vitro жағдайындағы 
рекомбинациясын іске асыру 1960 жылдың аяғында 1970 жылдың басында 
субстрат ретінде нуклеин қышқылдарын пайдалану бірегей қасиеттері бар 
жаңа ферменттер ашылғаннан кейін ғана мүмкін болды. 
Рестрикция ферменттері бактерия жасушасынан табылған. Барлық 
бактериялар қос тізбекті ДНҚ-ның белгілі нуклеотидтер бӛлігін үзе алатын 
бір немесе бірнеше рестриктазаларды синтездейді. Рестрикция 
ферменттерінің жасушадағы қызметі — бактерияға енген бӛтен ДНҚ 
молекуласынан қорғау. Рестрикция тоқтату деген мағынаны білдіреді. 
Рестрикция ферменттері фагтың нуклеин қышқылын үзіп, оның 
бактериялық жасушада кӛбеюіне жол бермейді. 
Әртүрлі рестриктазалардың II типінің ішінен ДНҚ-ның бір 
нуклеотидтер қатарын танитын екі немесе бірнеше ферменттер кездеседі. 
Осындай жұп немесе топ эндонуклеазалар изошизомерлер деп аталады. 
Изошизомерлердің екі түрін ажыратады: нағыз изошизомерия — 
ферменттер белгілі бір нуклеотидтер қатарын танып, ДНҚ-ны бір 
нүктелерде үзеді және жалған изошизомерия — ферменттер бір 
нуклеотидтер қатарын тани алғанымен, оларды әртүрлі үзеді. 
Рекомбинантты ДНҚ техникасы үшін алуан түрлі рестрикция 
ферменттерінің ішінен ӛздеріне комплементарлы «жабысқақ» ұштары бар 
фрагменттер түзетін рестриктазалар бағалы болып саналады. Гендік 
инженерияда қолданылатын ферменттер түрі бойынша таңдамалылығы 
болмайды. Сондықтан тәжірибе жасаушы кез келген нысаннан ДНҚ 
фрагменттерін ӛзі таңдаған бірізділік бойынша бір тұтас етіп үйлестіре 
алады. Осының нәтижесінде табиғатта кедергі келтіретін түр 
ерекшеліктері жойылады және түр аралық будандасуды іске асырады.
Рекомбинантты ДНҚ құрастыруға қажетті ферменттер келесі топтарға 
жіктеледі: 

рестриктазалар: олардың кӛмегімен ДНҚ алынады, кеседі. 

ДНҚ матрицасында ДНҚ синтездейтін полимеразалар 

36 

РНҚ матрицасында ДНҚ синтездейтін кері транскриптазалар 

ДНҚ фрагменттерін біріктіретін лигазалар 

ДНҚ ұштарындағы құрылымды ӛзгертуге мүмкіндік беретін 
ферменттер 
Жиі қолданылатын ферменттер. Рестриктазалар немесе рестрикциялық 
эндонуклеазалар. Бұл ферменттер ДНҚ молекуласындағы нуклеотидтердің 
белгілі бір бірізділігін (рестрикция сайттары) танып, сол жерді 
шабуылдайтын ферменттер «иесі бақылайтын» рестрикция «host controlled 
restriction» деп аталатын құбылысты зерттеу нәтижесінде ашылған. 1950ж. 
бактерия жасушасындағы фагтарды зерттеу барасында бактериялық 
вирустың ӛсу қабілеті оның соңғы рет кӛбейген бактерия штаммына 
байланысты болатындығы анықталған.
Рестриктазаларды танитын бірізділіктердегі азотты негіздердің 
метилденуі нәтижесінде модификацияланады. Сӛйтіп осы бӛліктің 
рестриктаза әсерінен қорғануы қамтамасыз етіледі.
Жасушада осы ферменттің белсенділіктің бір мезгілде болуы R-M 
жүйенің болуы, ағзаның ӛзіне тән нуклеин қышқылының гидролизденуіне 
жол бермейді. Бактерия жасушасына бӛгде ДНҚ енген кезде ешқандай 
генетикалық белсенділік кӛрсетпейді. Себебі, ұсақ фрагменттерге ыдырап 
кетеді. 
1966 жылы бұл құбылыс иесінің ДНҚ- ның арнайы модификациясымен 
байланысты болатындығы кӛрсетілген. Жаңадан енген жасушада 
болмайды. Метилдену репликация аяқталғанан кейін ғана жүреді. Бактерия 
ӛз ДНҚ- сын бӛгде ДНҚ-дан модификация типі бойынша ажырата алады. 
«Белгі» үшін модификацияның метилдеуші ферменттері жауап береді 
немесе оларды ДНҚ метилазалар деп атайды. Модификациясындағы 
айырмашылық әсіресе бӛгде ДНҚ-ның рестрикция ферменттерінің 
сезімтал болуын, яғни сәйкес сайттарында метилді топтардың болмауын 
тануға мүмкіндік береді. Алғашқыда R-M жүйенің жалғыз қызметі 
жасушаны фагтарды жұқтырудан қорғануы деп есептеген. Бірақ одан 
кейінгі зерттеулер барысында R-M жүйелер әр түрге жататын бактериялар 
және штаммдар арасында будандасуды шектейтін қызметті атқаратындығы 
туралы болжам жасалған. Бұл қызмет абсолютті емес, себебі, ДНҚ 
бӛліктері жасушаға еніп, рекомбинацияланып, генетикалық қор сапасын 
жақсартуға 
эволюциялық 
басымдылық 
береді. 
Сонымен 
қоса, 
бактерияларда 
түрді 
анықтау 
қиынға 
түседі. 
Тіпті 
барлық 
микроағзалардың жалпы гендік қоры туралы болжам бар, осыған сәйкес 
толып жатқан бактериялардың жаңа түрлері пайда болуы тиіс. Ал іс 
жүзінде бактериялардың морфологиялық, генетикалық сипаттамаларының 
белгілі бір тұрақтылығы байқалады. Яғни, генетикалық оқшаулануды іске 
асыру үшін осы рестрикция модификация жүйелері маңызды рӛл атқарады. 
Бактерияларда R-M жүйелер кең таралған. Метилденбеген ДНҚ 

37 
ыдырататын рестриктазаны 1968ж. М.Мезельсон және Р.Юань бӛліп алған. 
Бұл фермент ДНҚ бірізділігіне байланысты жоғары таңдамалы болып, 
бірақ молекуланы танитын бӛлігінен басқа алыс жерден үзетін болған. 
1970 ж Смит және Вилькокс тек белгілі бір бірізділікті ыдырататын 
рестриктазаны (Hind III). алғаш бӛліп алған. Әртүрлі бактериялар ӛз ДНҚ-
сын әртүрлі белгілейтін болғандықтан рестриктазалар да әртүрлі 
бӛліктерді тануы тиіс. Оларда кофактор ретінде магний иондары болады. 
2007 жылға дейін 2000 жуық рестриктазалар анықталып, бӛліп алынған. 
Қазіргі кезде қолданыста екінші типке жататын 600-ден аса рестриктазалар 
бар. Адам геномын редакциялауда CRISPR-Cas9 эндонуклеазалық жүйе 
қолданылады. Ол ДНҚ-ның белгілі бірізділіктерін комплементарлы «гид» 
РНҚ арқылы танып, үзеді. Сонымен қоса мырыш саусақты ДНҚ 
байланыстырғыш пен эндонуклеазалық домен біріктірілген жасанды 
рестриктаза, TALEN TAL- эффектордың ДНҚ байланыстырғыш домені 
мен эндонуклеазалық ДНҚ домені біріктірілген жасанды рестриктазалар 
бар. 
Рестриктазалардың 
бӛлінуі, 
жіктелуі, 
номенклатурасы 
және 
сипаттамасы:
Сайтты арнайы танитын эндодезоксирибонуклеаза деген аты да бар.
Х.Смит және Д.Натанс 1973 жылы рестриктазалардың номенклатурасын 
ұсынды. Ол келесідей пункттерден тұрады: әрбір ферменттің аталуы 
белгілі бір R-M жүйесі бар ағза туыс- түр бинарлы атауынан шығарылады. 
Құрылу схемасы: Eco – Escherichia coli, Hin – Haemophilus influenzae, Pst – 
Providentia stuartii, Hpa – Haemophilus parainfluenzae, Sal – Streptomyces 
albus;

Туыс пен түрдің атынан кейін қажет болған жағдайда штаммды 
немесе серотипті белгілейді. Мысалы: Haemophilus influenzae d-серотипі - 
Hind; Escherichia coli B –штаммы - EcoB.

Бір бактериялық жасушадағы әртүрлі R-M жүйелерді белгілеу үшін 
рим цифрларын пайдаланады: Hind I, Hind II, Hind III (13-сурет). 

R-M жүйелері жалпы күйде R-эндонкулеаза, ал метилазасы –M 
әріпімен белгіленеді. Мысалы, RHind II, MHind II. 

Егер R-M жүйе фагтың геномында генетикалық шоғырланған болса 
немесе плазмида шоғырланса онда түр туыстық аталуы хромосомадан тыс 
элемент символы кӛрсетіледі. Мысалы, EcoPI (плазмида), EcoRII (сырттан 
фаг арқылы енген фактор), Eco(K)PІ (штамм жақша ішінде болады).

Кейде туыс-түр акронимінен кейін коллекциядағы бактериялық 
ӛскіннің нӛмірі кӛрсетіледі. Мысалы, Pvu84II, Hinb1076III. 
Бактериялардың барлық рестрикциялық эндонуклеазалары ӛте қысқа 
арнайы ДНҚ бірізділіктерін тани алады және онымен байланыса алады. 
Бұл үдеріс барысында табылған сайт немесе одан басқа бӛлікте фермент 
типіне сәйкес ДНҚ кесілуі жүреді.

38 
13-сурет - Шығыңқы «жабысқақ» ұштар түзетін рестриктаза
Ніnd III және «доғал» ұштар түзетін рестриктаза Нра І 
Метилаза метилдік топтарды рестрикция сайтындағы аденинді, 
цитозинді қалдықтарды қосуды катализдейді. Рестриктазалардың негізгі 
үш типі ажыратылады.
Барлық рестрикциялар қос тізбекті ДНҚ-ның тек белгілі бір бӛлігін 
тани алады. Бірақ біріншілік типке жататын рестриктазалар ДНҚ 
молекуласының әртүрлі нүктелерінде еркін түрде үзілуін іске асырады. Ал 
екінші және үшінші типке жататын ферменттер күрделі суббірлікті 
құрылым болып табылады және екі түрлі белсенділіктері бар: метилдеуші 
және АТФ тәуелді эндонуклеазалық белсенділік. Екінші типке жататын 
ферменттер екі түрлі нәруыздардан құралады: рестрикциялаушы және 
модифицирлеуші. Сондықтан гендік инженерияда тек екі типке жататын 
ферменттер қолданылады.
Рестриктазалық ферменттердің типтері (14-сурет).
14-сурет –ДНҚ рестриктаза EcoR1 (ІІ-типтегі рестриктаза) 

39 
ДНҚ тізбегінің үзілуі не симметрияның осі бойынша жүруі мүмкін, 
онда «доғал» ұшты фрагменттер түзіледі (мысалы, Ваll немесе ВsuRI 
рестриктазалары), не симметрия осінен біршама қашықтықта ӛтуі мүмкін, 
онда шығыңқы «жабысқақ» 5' (ЕсоRІ, Ніnd III— және т. б. рестриктазалар) 
немесе 3' (РstІ рестриктазасы) ұштары бар фрагменттер түзіледі.
Рестриктазалардың ІI типінің басым кӛпшілігі 4—6 н. ж. құралған 
палиндромды ДНҚ тізбектерін тани алады. Мысалы, Вас.subtilis 
бактериясының ВsuR1 деп белгіленетін рестриктазасы. EcoIII рестриктаза 
ДНҚ тізбегін үзген кезде «жабысқақ» ұштар пайда болады. Бір ұшы ішке 
кіріп тұратын 3' гидроокси тобы. Ал екіншісі 5' фосфат тобы бар тізбектер 
түзіледі. Палиндром бӛліктерді тани алады (бір мағынаны береді, айнадағы 
кӛшірме сияқты). Оқылуы бір бағытта да, кері бағытта да бірдей болады. 
Бұл эндонуклеазалар генді клондау кезінде маңызды болады. 
Полимеразалар. ДНҚ-полимеразаны алғаш рет 1958 жылы Корнберг 
және оның әріптестері E. coli-дан бӛліп алған (15-сурет). 
15-сурет – E.coli ДНҚ полимеразасының құрылымы 
E. coli ДНҚ-полимеразасы I (Pol I) екі тізбекті сақиналы күйдегі ДНҚ 
молекулаларымен байланыспайды. Бірақ осы ДНҚ-ны денатурациялап бір 
тізбекті күйге келтірсе, онда полимераза осы тізбектің ұзындығына 
пропорционал мӛлшерде байланысады, шамамен бір молекуласына 300 
нуклеотидтік қалдықтан келеді. Pol I ажыраған тізбектердің 3' гидроксиль 
және 5' фосфат ұштарымен, қос тізбекті ДНҚ бос ұштарымен 
байланысады. Pol I молекулалық массасы 103 кДа және үш домендік 
құрылымды мономерлік полипептидтік тізбектен тұрады. Әрбір домен 
ӛзіндік ферментативті белсенділікке ие: 5’ - 3’ полимеразалық, 3’ - 5’ 
экзонуклезалық, 5’ - 3’ экзонуклеазалық. 

40 
5'—3' полимеразалық белсенділік ДНҚ тізбегі синтезін қамтамасыз 
етеді. Субстраты бір тізбекті ДНҚ-матрицасы және бұл тізбектің бӛлігіне 
комплементарлы 3'-ОН ұшы бар үзінді-праймер болуы қажет. 
3'-5' экзонуклеазалық белсенділік тізбекті бос 3'-ОН ұшынан үзіп 
ыдыратуды қамтамасыз етеді. Субстраты бір тізбекті және екі тізбекті 
ДНҚ, алайда екі тізбекті ДНҚ–да бұл белсенділік ферменттің 
полимеразалық белсенділігімен тоқтатылады.
5'—3' экзонуклеазалық белсенділік тізбекті бос 5'-ұшынан үзуді 
қамтамасыз етеді. Реакция субстраты екі тізбекті ДНҚ. 
Фермент белсенділіктерінің мұндай үйлесімділігі in vivo репарация 
кезінде ДНҚ зақымдануынан қорғайды. ДНҚ полимераза І нуклеотидті 
тізбектің 5'—3' бағытта бір мезгілде полимерленуі мен гидролиздену 
реакцияларын жүргізе алады (процесс ник трансляция деп аталады). Ник 
ДНҚ тізбегі бойымен 5'—3' бағытта орын ауыстыратындықтан in vitro
радиоактивті белгі салуға қолданылады. Гендік инженерияда кӛбінесе бұл 
ферменттің Кленов үзіндісі қолданылады, оның тек полимеразалық және 
3'-5' экзонуклеазалық белсенділіктері сақталады. Кленов үзіндісін бір 
жіпшелі «салбыраңқы» 5' ұштарды нуклеотидтермен толтыру, ДНҚ 
фрагменттерінің ұштарына радиоактивті белгі салу, рестрикттердің 
«доғал» ұштарына радиоактивті белгі салу (полимеразаның 3'-ұштағы 
нуклеотидті үзіп, реакциялық ортадағы жаңа нуклеотидпен алмастыру 
қасиетін пайдаланады), кДНҚ-ң екінші жіпшесін синтездеу, Сэнгер әдісі 
бойынша ДНҚ-ғы нуклеотидтік бірізділікті анықтау, ДНҚ арнайы сайттық 
мутагенезі үшін пайдаланады.
Кері транскриптаза. Бұл фермент екі суббірліктен құралады: α 
суббірлігі (65 кДа), δ суббірлік (95 кДа). РНҚ-ға тәуелді ДНҚ полимераза, 
ДНҚ-ны 
РНҚ 
мен 
ДНҚ 
матрицаларында 
синтездейді. 
Кері 
транскриптазаны in vitro кДНҚ (комплементарлы тізбек) синтездеу үшін 
қолданады. Кері транскриптаза кем дегенде үш ферменттік белсенділікке 
ие: ДНҚ полимеразалық белсенділігі, тек гибридті ДНҚ-РНҚ құрамындағы 
РНҚ-ны гидролиздейтін РНҚ–аза H белсенділігі, ДНҚ эндонуклеазалық 
белсенділігі. Кейде кері транскриптазаны ревертаза деп те атайды. Ең 
жақсы зерттелген құстардың ретровирусының ревертазасы. Әрбір вирион 
құрамында бұл ферменттің шамамен 50 молекуласы кездеседі. Алғашқы 2 
белсенділік вирустық ДНҚ-ны синтездеу үшін, ал эндонуклеаза вирустық 
ДНҚ-ның жасуша иесі геномына интеграциясы үшін қажет. 
Синтезді бастау үшін ревертазаға екі тізбекті қысқа бӛлік праймер 
қажет. Праймер рӛлін жаңа синтезделген ДНҚ тізбегімен ковалентті 
байланыс түзетін РНҚ тізбегі және ДНҚ бір тізбекті бӛліктері атқара 
алады.
Лигаза - ДНҚ үзінділерін біріктіретін ферменттер. Кофакторларға 
қажеттілігі мен әсер етуіне қарап екі түрге бӛледі: 

41 
1.
«Жабысқақ» ұштарды біріктіру (16-сурет). 
2.
«Доғал» ұштарды біріктіру (17-сурет). 
16-сурет – ДНҚ – лигаза. «Жабысқақ» ұштарды біріктіру 
17-сурет – ДНҚ- лигаза. «Доғал» ұштарды біріктіру 
Лямбда фагының экзонуклеазасы. Бұл фермент үшін реакция 
субстраты екі жіпшелі ДНҚ болып табылады. Ол 5' тізбектің ұшынан 
мононуклеотидтерді 5' фосфат тобы арқылы үзуді катализдейді. Лямбда 
фагының экзонуклеазасын ары қарай секвендеу мақсатында бір жіпшелі 
ДНҚ-лар алу үшін қолданады. 
E.coli экзонуклеазасы III. Фермент ДНҚ молекулаларының екі жіпшелі 
3'-OH 
ұшынан 
бастап 
мононуклеотидтерді 
үзуді 
катализдейді. 
Экзонуклеаза III S1 нуклеазамен бірге ДНҚ фрагменттерін қысқарту үшін 
қолданылады, ал ДНҚ полимеразамен бірге радиоактивті зат белгісін 
енгізу үшін қолданылады. 
ДНҚ-аза мен РНҚ-аза. Бұл ферменттер тиісінше ДНҚ мен РНҚ 
гидролизіне қолданылады. 

42 
Т4 фагының полинуклеотидкиназасы (Т4 фагын жұқтырған E. coli-ден 
алынады). Бұл фермент АТФ молекуласынан фосфат тобын ажыратып, 
оны 
полинуклеотидтің 
5'-ұшына 
жалғайды. 
Бұның 
субстраты 
дефосфорланған, яғни 5'-ұшында фосфат тобы жоқ бір жіпшелі РНҚ 
немесе екі жіпшелі ДНҚ молекуласы болып табылады. Бұл ферменттер 
Максам-Гильберт әдісі бойынша 5'-ұшына белгі салу арқылы ДНҚ 
фрагменттерінің нуклеотидтер бірізділігін анықтау үшін және 5'-ұшында 
фосфат тобы жоқ (жасанды ДНҚ) линкер молекулаларды байланыстыру 
және басқа да ДНҚ фрагменттері үшін пайдаланылады. 
Терминалды дезоксинуклеотидилтрансфераза. Фермент екі жіпшелі 
ДНҚ фрагменттерінің 3'-ОН ұштарына нуклеотидтерді дәйекті түрде 
қосуды катализдейді. Клондауға қажетті (кДНҚ) ұзын гомополимерлі 
(коннектор) бірізділіктердің 3'-ОН ұштарын ұзартады және 3'-ОН ұштарға 
радиоактивті белгі салуға қолданылады. 
Сілтілік фосфатаза. ДНҚ немесе РНҚ-ң 5'-ұшындағы фосфат топтарын 
ыдыратуды және үшфосфаттардың макроэнергетикалық байланыстарын 
ажыратуды катализдейді. Сілтілік фосфатазаны ДНҚ-ң 5'-ұшына 
радиоактивті белгі салуға дайындағанда және вектор молекулаларының бір 
бірімен ӛзара жалғануын болдырмау үшін қолданады 

жүктеу/скачать 1,31 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: