Характеристики и особенности некоторых современных методов исследования, используемых в биохимической практике

В семидесятых годах (1966-1969 гг.) были опубликованы первые сообщения о возможности присоединения к белкам молекул фермантов.

В основе метода лежит взаимодействие между ат и аг, один из которых метится ферментной меткой. Одной из причин широко в настоящее время распространения данного метода, то что он наряду с точностью и специфичностью поддается автоматизации.

Широкое распространение метод ИФА получил при определении антител против бактериальных и вирусных антигенов. Метод ИФА можно широко использовать для обнаружения специфических антигенов возбудителей тех же заболеваний, а также самых различных химических соединений, которые могут выступать в качестве антигенов или гаптенов-антибиотиков, гормональных препаратов, микотоксинов, пестицидов и др.

Методы ИФА могут быть разделены на гетерогенные (твердофазные, ELISA) и гомогенные (EMJT ) отличаю­щиеся по принципу проведения анализа. Гетерогенные методы ИФА основаны на использовании антигенов и антител, иммобилизованных на нерастворимых носителях (как правило пластик).

Гомогенные методы основаны на эффекте модуляции антителами активности фермента (или кофактора) ис­пользуемого в качестве метки антигена.

В настоящее время разработано много вариантов ИФА-анализа. Среди этих методов можно выделить 2 типа: это методы последовательного (или неконкурентного) анализа и конкурентного анализа.

Метод неконкурентного анализа связан с осуществлением двухстадийного процесса. На первой стадии антите­ла адсорбированные на нерастворимом носителе взаимодействуют с антигеном. Не связавшиеся компоненты отмывают и затем добавляют раствор, содержащий антитела, конъюгированные с ферментом. Вторая стадия процесса также за­вершается отмывкой не связавшихся компонентов реакционной смеси после чего в систему вводят соответствующий субстрат для осуществления индикаторной ферментативной реакции.

При конкурентном гетерогенном анализе присутствующие в реакционной среде одновременно связанные и не­связанные с ферментативной меткой антигены (гаптены) вступают в конкурентное взаимодействие с иммобилизован­ными на твердом носителе антителами. После инкубации избыток не связавшихся компонентов отмывают и в систему добавляют соответствующий субстрат.

Вторым этапом является внесение в лунки планшета с адсорбировавшими антителами определяемого соедине­ния (антигена) и раствора коньюгата, представляющего собой молекулы антигена, химически меченые молекулами фермента. В течение некоторого периода инкубации происходит адсорбция как меченых, так и немеченых антигенов. Поэтому после отмывки буферным раствором на поверхности носителя останутся как меченые, так немеченые (опреде­ляемые) антигены, соотношение которых зависит от исходной концентрации антигенов определяемого раствора.

Четвертым этапом является добавление в лунки планшета фиксирующего реагента прекращающего фермента­тивную реакцию.

Фильм.

ПЦР может выявлять участок ДНК который принадлежит вирусу или определенной мутации, при условии, что последовательность нуклеотидов этого участка известна.

Для проведения ПЦР-анализа не требуется культивированного инфекционного агента. Выявление специфиче­ского участка ДНК методом ПЦР прямо указывает на присутствие возбудителя. Вся процедура с момента приготовле­ния пробы до электрофоретического анализа полученных в ПЦР фрагментов занимает 4-6 часов и позволяет анализиро­вать до 20 проб в течение одного рабочего дня.

ПЦР позволяет анализировать

ПЦР позволяет выявить штаммы вируса циркулирующего в стаде. Т.е. можно отличить вакцинный штамм от полевого и т.д.

Схема постановки реакции.