Микробиологиялыќ зертхана
жүктеу/скачать 6,39 Mb. Pdf көрінісі
|
сабақ түсіндірген бойынша
| Дақтардың түзілуін анықтау әдісі
вирустарды титрлеуде, вирустардың таза популяциясын алуда және олардың генетикалық қасиеттерін анықтауда кеңінен қолданылады. Бұл әдіс құрамында нейтральрот бояуы бар агармен қапталған дара қабаттарында (вируспен зақымдалған жасуша өсінділерінің) дақтардың немесе негативті колониялардың пайда болуына негізделген. Дақтар вирустардың әсерінен өлген жасушалардан тұратын, өсінділердің түссізденген учаскесі. Вирустардың бір орыннан екінші бір жерге ауысуына жол бермеу мақсатында пайдаланылатын агардың орнына крахмал мен метилцеллюлозаны да қолдануға болады. Көптеген ғалымдар бұл әдісті жылқылардың энцефаломиелиті, аусыл, везикулярлы стоматит, ірі қара обасы, құс обасы, Ньюкасл ауруы, полиомиелит, шешек вакцинасы Коксаки вирустары мен кейбір герпес вирустардың өкілдерін зерттеуде қолданған. Дақтардың түзілу әдісін қоюда қолданылатын жасуша өсінділерінің сапасы жақсы, жасушалар біркелкі және дегенерацияланбаған болуы керек. Қоректік ортамен немесе Хенкс ерітіндісімен шайылған жасушаларға қажетті сұйылтымдағы вирусы бар материалды құйып, жасуша мен вирустың бір-бірімен байланысқа түсуін қамтамасыз ету үшін нақты бір уақыт аралығында (1-2 сағат) +37-38ºС температурада ұстайды. Сонан соң жасушаларға адсорбцияланбаған вирустарды Хенкс ерітіндісімен шайып тастайды да, дара қабатты жасушалардың бетін арнайы агар ерітіндісімен қаптайды. Жасуша беткейін қаптауға арналған ортаны вирустардың түріне қарай таңдайды. Арнайы орта компоненттері: агардың 2,5%-ды ерітіндісі – 90 мл; Эрл ерітіндісі (10 Х концентраты) – 18 мл; бидистилденген су – 60 мл; бұзау қан сарысуы – 3,6 мл; бейтарапты қызыл (1:1000), сода ерітіндісі (NaHCO 3 ) – 5,4 мл; пенициллин (100000 ӘБ/мл) – 0,18 мл; стрептомицин (100000 ӘБ/мл) – 90 0,18 мл. Барлық компоненттерді +45-50ºС температурада араластырады да, ортаның температурасын +36-38ºС-ге дейін салқындатып, жасуша дара қабатының беткейін қаптайды. Агар қатқаннан кейін ондағы конденсацияланған ылғалды төгіп, матрасты (флаконды) аударылған күйінде термостатта инкубациялайды. Инкубация уақыты мен температурасы зерттеуге алынған вирустың дақтарды түзуіне сәйкес болуы қажет. Дақтардың түзілуін бірнеше тәулік бойы бақылап отырады. Осы уақыт аралығында жасушаға адсорбцияланған вирустар жасуша ішіне еніп, репродукцияланғаннан кейін шығады да көрші жасушаларды зақымдайды. Бірыңғай орналасқан тірі жасушалар арасында вирустардың репродукциялануының әсерінен өлген жасушалардан құралған дақтар көрінеді. Қолданылған бояу ерітіндісімен тек тірі жасушалар қызғылт түске боялады. Сондықтан матрастағы бірыңғай қызыл түсті аяда (фон) түссіз дақтар пайда болады. Дақтардың пайда болуы уақыты мен морфологиясы вирустың түріне, штамына, жасушалардың типі мен оларды өсіру жағдайына байланысты болады. Жасуша ішінде ерекше қоспалардың (денешіктердің) түзілуін айқындау. Көптеген вирустық ауруларға ұшыраған жануарлардың органдары мен ұлпаларының жасушаларында (цитоплазмада немесе ядрода) ерекше қоспалар – денешіктер пайда болады. Ерекше денешіктер жасушада жиналуына, нуклеин қышқылының құрамына, тинкториальдық қасиеттері мен гомогендігіне қарай жіктеледі. Ондай денешіктер шешек, тұмау, құтырық, парагрипп және т.б. вирустық ауруларда жасушалардың цитоплазмасында орналасса, ал ірі қара ринотрахеиті, құс ларинготрахеиті, аденовирустық, т.б. инфекцияларда денешіктер жасушалардың ядросында пайда болады. Вирус денешіктерін анықтауға арналған препараттарды дайындау үшін жұқтырылған жасуша өсінділерін шыны түтіктерге немесе флакондарға салынған жапқыш шыныларда өсіріп, зерттеуге алынған вирустық материалдармен жұқтырады да, белгілі бір уақыт аралығында +37ºС-де инкубациялайды. Инкубация уақыты аяқталғаннан кейін шыныларды алып, жылытылған Хенкс немесе физиологиялық ерітіндімен (рН 7,0-7,2) шайып, сүзгіш қағазбен кептіргеннен кейін арнайы қоспалардың бірімен бекітеді: Буэн ерітіндісінде – 10-15 минут, Карнуа бекіткішінде – 10 минут, Ценкер ерітіндісінде – 20-30 минут, метил спиртінде – 10 минут. Сосын препараттарды түрлі әдістермен бояйды. Гематоксилин-эозинмен боялған препараттардан вирус денешіктері айқын көрінеді. Ол үшін жапқыш шыныға бекітілген жасушаларды дистилденген сумен шайып, 10-15 минут бойы гематоксилин (Майер, Эрлих, Карацци, т.б) ерітіндісімен өңдейді. Сонан соң препаратты сумен шайғаннан кейін 1-2 минут аммиакты суда (200 мл дистилденген су + 3 тамшы аммиак) ұстайды. Сілтілі орталарда жасуша ядросы көк түске боялады. Сонан соң препаратты эозиннің 0,1%-ды судағы ерітіндісімен 91 30-60 секунд бояп, сүзгіш қағазбен құрғатқан соң спирттің концентрациясын бірте-бірте арттыра отыра өңдейді: 70, 80, 96, 100º+ксилол (1:1), ксилол. Препаратты әрбір спирт пен ксилолда 1 минутқа дейін ұстайды. Әрбір сұйықтыққа ауыстырар алдында препаратты міндетті түрде сүзгіш қағазбен сорықтырып отыру қажет, әйтпесе спирт суланып кетеді. Гемотоксилин-эозинмен жасуша ядросы – көк түске, цитоплазмасы – қызғылт, ал денешіктер вирустардың түрлеріне қарай көк немесе қызғылт түске боялады. Қан, жілік майының жасушаларын немесе лимфоидты мүшелерден алынған жасуша өсінділерін бояуда Романовский-Гимза әдісін қолданады. Вирусология тәжірибесінде вирус денешіктерін анықтау үшін жасушалардан дайындалған препаратты қызғылт сары түсті акридинмен флуорохромдау әдісі жиі қолданылады. Флуорохромдау әдісіне арналған препараттарды екі жолмен дайындауға болады: а) патологиялық материалдардан немесе жұқтырылған жасуша өсінділерінің суспензияларынан дайындалған жағындыға 1-2 тамшы қызғылт сары түсті акридиннің 1:10000 қатынасындағы ерітіндісін тамызады да, бетін жапқыш шынымен жабады. Дайын препаратты 10-20 минуттан кейін лиминесцентті микроскоппен қарайды; ә) мұнда жағындыны 15-30 минут бойы 96º этил спиртімен бекітіп, Хенкс ерітіндісімен шаяды да, оған 1-2 тамшы қызғылт сары түсті акридинн ерітіндісін тамызып, бетін жапқыш шынымен жапқаннан кейін зерттейді. Осы тәсілдермен боялған препараттардағы жасуша ядросының ДНҚ жасыл түсті асыл тас тәрізді, ал цитоплазма РНҚ қызыл немесе қызғылт сары түске боялады. ДНҚ-ды вирустармен (аденовирустар) зақымдалған жасушалардың ядросындағы гранулалаланған денешіктер жарқыраған жасыл түсті болып көрінеді. РНҚ-ды вирустармен (тұмау) зақымдалған жасуша цитоплазмаларындағы вирустық материалдар ашық-қызыл түсті гранулалар күйінде байқалады. Жасушаның ДНҚ мен РНҚ-нан вирус денешіктерін ажырату үшін препаратты рибонуклеаза немесе дезоксирибонуклеаза ферменттерінің 0,5%-ды ерітіндісімен 10-15 минут өңдейді немесе ультракүлгін сәулелерімен сәулелендіреді. Бұл жағдайда жасушалардың ДНҚ мен РНҚ-ның жарқырауы жойылып кетеді, ал вирустық денешіктер 20-30 минутқа дейін жарқырайды. Вирустарды иммунды флуоресценция реакциясы (ИФР) және иммунды ферменттік талдаумен (ИФТ) анықтау әдістерін жасуша өсінділеріндегі вирустардың цитопатогендік әсері мен гемадсорбция құбылысы байқалмаған жағдайда қолданады. ИФР-да флуорохроммен таңбалан телімді антиденелер, ал ИФТ-да пероксидаза ферменттерімен таңбалан антиденелер пайдаланылады. (Бұл әдістер туралы мәліметтер 120-125 беттерінде толық көрсетілген). 92 Вирустардың интерференциясына негізделген әдіс. Бұл әдіс бір вирус екінші вирустың көбеюін тежейтін процесті анықтауға бағытталған. Мысалы, шошқаның оба вирусы аусыл вирусының, ал ньюкасл ауруының қоздырғышы везикулярлық стоматит вирусының инфекциялық белсенділігін төмендетеді. Әдетте аталмыш әдісті жасуша өсінділерінде цитопатогендік әсерді тудырмайтын вирустарды анықтау жұмыстарында пайдаланады. Жасуша өсінділеріндегі шошқаның оба вирусын (ЦПӘ тудырмайды) анықтау үшін оған екінші бір вирусты (аусыл) жұқтырып, +37ºС температураға реттелген термостатта бірнеше күн инкубациялағаннан кейін микроскоппен зерттейді. Егер жасуша өсінділерінде ЦПӘ байқалмаса, онда шошқа обасының вирусы бар деп есептеледі. Ал жасушаларда ЦПӘ байқалса, онда шошқа обасының вирусы жоқ деп саналады. Бұл жағдайда жасушалардағы ЦПӘ аусыл вирусының әсерінен болады. Сонымен қатар интерференция әдісін жасуша өсінділерінде ЦПӘ тудырмайтын вирустарды титрлеу жұмыстарында да пайдаланады. жүктеу/скачать 6,39 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|