Оптимизация условий криосохранения образцов картофеля

Биотехнология. Теория и практика. 2013, №4, стр. 42-49 
DOI: 10.11134/btp.4.2013.6
3 
Для оздоровления растительного материала от вирусных и грибных болезней проводили термотерапию 
чистых клубней картофеля. Клубни картофеля помещали в термостат и повышали температуру от 25° до 
37°С путем ежедневного увеличения температуры на 2°С.
Введение растительного материала картофеля 
in vitro
проводили в стерильных условиях ламинар-боксе 
по описанной методике Калашниковой Е.А., Кочиевой Е.З., Мироновой О.Ю. [11]. Для получения 
апикальных меристем проращивали сорта и формы картофеля в термостате при температуре 37°С и 70% 
относительной влажности воздуха. Вычленение верхушечных апикальных меристем проводили в 
стерильных условиях. Перед вычленением меристемные ростки стерилизовали в стерилизующих растворах: 
Твин 20 (Tween 20, вязкая жидкость, монолаурат полиоксиэтиленсорбитана) и растворах коммерческих 
хлорсодержащих реагентов – «Белизна» (активный хлор 2,8%, гидроксид натрия 2,0%), разбавленных 
дистиллированной водой в концентрации – 20; 70; 100% в течение 7 или 10 минут. Затем ростки промывали 
три раза стерильной дистиллированной водой и переносили на питательную среду МС для получения 
меристемных линий. Культивировали апикальные меристемы в фактеростатной комнате с 16-часовым 
световым режимом, освещенностью – 5-6 тыс. люкс, температурой 22-25
о
С, влажностью 70%. Через 50-60 
дней из выделенных апикальных меристем вырастали пробирочные растения
. 
Для сохранения в культуре 
in vitro
и жидком азоте выросшие меристемные линии в 3-ем пассаже были 
протестированы с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) на вирусы PVХ, PVY, PVS, PVM и PLRV. 
Линии, показавшие наличие концентрации вирусной инфекции, выбраковывались. 
Затем оздоровленные меристемные линии картофеля постоянно микроклонально размножали через 
каждые 24-28 дней. Выросшие пробирочные растения картофеля с 5-6 листочками периодически 
черенковали и пересаживали в пробирки со свежей питательной средой. Из этих черенков снова вырастали 
новые пробирочные растения.
Для криоконсервации использовали простерилизованные апикальные меристемы размером 3-5 мм, 
выделенные из глазков клубней сортов и форм картофеля. Апикальные меристемы помещали в 
эпиндоровские пробирки для криоконсервации и за 2 часа до замораживания вносили криопротекторы 
ДМСО в концентрации 10% и глицерин – 20%. Использовали медленное и быстрое замораживание клеток 
апикальных меристем. При медленном замораживании проводили постепенное понижение температуры от 
+20 до 
–
28°С на спиртовой бане. При быстром замораживании апикальные меристемы в эпиндоровских 
пробирках сразу погружали в жидкий азот. Далее эпиндоровские пробирки с апикальными меристемами 
перенесли в жидкий азот на хранение. 

жүктеу/скачать 0,67 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: