Системы адаптивного иммунитета crispr/Cas обеспечивают устойчивость к вторгающимся фагам и конъюгативным плазмидам у бактерий и архей [39-41]

жүктеу/скачать 20,66 Kb. Дата 11.11.2022 өлшемі 20,66 Kb. #157804

Системы адаптивного иммунитета CRISPR/Cas обеспечивают устойчивость к вторгающимся фагам и конъюгативным плазмидам у бактерий и архей [39-41]. Иммунитет, опосредованный CRISPR/Cas, включает три этапа: адаптацию (во время которой спейсеры извлекаются из генома захватчика и интегрируются в геном бактерий), биогенез crRNAs, образующих экспрессируемые массивы CRISPR, и молекулярную интерференцию против генома вторжения или нуклеиновой кислоты [42, 43]. Все известные системы CRISPR/Cas подразделяются на два основных класса: класс I, в котором мультиэффекторные белковые комплексы опосредуют интерференцию, и класс II, в котором для опосредования интерференции используются одиночные многодоменные эффекторные белки. Эти два класса далее подразделяются на 6 типов и 33 подтипа на основе геномной архитектуры матрицы CRISPR, а также сигнатурного интерференционного эффектора. Например, системы CRISPR/Cas класса I включают типы I, III и IV, а класс II включает типы II, V и VI [46]. Примечательно, что системы CRISPR/Cas типа I, II и V нацелены на ДНК-геномы вторгающихся фагов или конъюгативные плазмиды, но типы III и VI нацелены в основном на одноцепочечную РНК вторгающихся фагов, что приводит к молекулярному иммунитету против вторгающихся нуклеиновых кислот. [68, 133, 139, 140]. Усилия по интеллектуальному анализу данных микробного генома и подходы к вычислительному прогнозированию для поиска ранее неисследованных систем CRISPR Cas класса II привели к открытию различных новых систем CRISPR класса II, включая C2c1, C2c2 и C2c3 [46]. Было обнаружено, что C2c1 и C2c3 содержат RuvC-подобные эндонуклеазы, аналогичные Cpf1, и поэтому были классифицированы как системы CRISPR/Cas типа V класса II, известные как Cas12b типа V-B и Cas12c типа V-C соответственно [49]. В отличие от этих других нуклеаз Cas, было обнаружено, что кандидат 2 класса II (C2c2), обозначенный как Cas13a, обладает уникальными свойствами, отсутствующими ни в каких других известных белках Cas. Анализ последовательности белка Cas13a выявил наличие двух нуклеотидсвязывающих доменов высших эукариот и прокариот (HEPN), которые, как известно, связаны с активностью РНКазы [67]. Эти отличительные характеристики белка Cas13a выдвинули заманчивую возможность того, что CRISPR/Cas13a работает как единый РНК-управляемый эффектор, нацеленный на РНК. Недавняя работа, характеризующая функциональность CRISPR/Cas13a из Leptotrichia shahii (LshCas13a), показала, что единственный эффекторный белок Cas13a действительно является программируемой одноцепочечной рибонуклеазой, управляемой РНК (ssRNA) [68]. Было показано, что Cas13a обеспечивает иммунитет против бактериофагов в Escherichia coli путем интерференции с литическим ssRNA-фагом MS2. Cas13a, управляемый crRNA, содержащей 28-нт-спейсерную последовательность, опосредовал расщепление целевых ssRNAs in vitro и in vivo с помощью протоспейсерной фланкирующей последовательности (PFS) A, U или C. Было показано, что на каталитическую активность Cas13a влияют вторичные структуры последовательности-мишени, где Cas13a имеет тенденцию преимущественно расщепляться на урацильных остатках множества сайтов во вторичных структурах, образованных в субстратах ssRNA. Кроме того, было показано, что два домена HEPN ответственны за РНКазную активность Cas13a, а мутация предполагаемых каталитических остатков аргинина в обоих доменах отменяет активность расщепления РНК, что приводит к каталитически неактивной версии фермента Cas13a (dCas13a). Однако, подобно dCas9, dCas13a сохраняет свою способность специфически связываться с РНК-мишенью и, следовательно, может быть повторно использован в качестве РНК-ориентированного белка, связывающего РНК [68, 141]. Cas13a также может допускать несовпадения с одним основанием, но не двойные несовпадения в середине последовательности спейсера crRNA - обрезки основания протоспейсера, что указывает на наличие центральной затравочной последовательности. Важно отметить, что система продемонстрировала свою способность быть перепрограммированной для специфического нацеливания на нефаговые РНК in vivo путем подавления экспрессии белка RFP в E. coli. Интересно, что Э. клетки coli, экспрессирующие RFP и активный механизм CRISPR/Cas13a, нацеленный на транскрипт RFP, демонстрировали сниженный рост, что, как было обнаружено, связано с активностью по деградации сопутствующей РНК на основе Cas13. Сопутствующая активность деградации РНК Cas13a требовала специфического и успешного нацеливания на целевую последовательность и активации белка Cas13a. Такое сопутствующее нацеливание могло бы обеспечить средства для различных полезных инструментов для различных биотехнологических применений [68]. Ист-Селецкий и др. (2016) [66] показали, что Cas13a проявляет двойные, различные функции в процессинге и биогенезе пре-crRNA, а также деградации ssRNA-мишеней. Эти активности Cas13a облегчили бы конструирование и экспрессию множества crRNA под контролем одного промотора для нацеливания на множество транскриптов. Подобно LshCas13a, LbuCas13a из Leptotrichia buccalis управляется crRNAs для нацеливания на специфическую последовательность ssRNA, что также приводит к сопутствующей неспецифической активности [66]. Исследование также показало, что коллатеральная расщепляющая активность Cas13a может быть полезной для обнаружения и определения присутствия специфических транскриптов РНК. Основываясь на этой идее, недавнее исследование использовало побочный эффект беспорядочной активности РНКазы Cas13a при распознавании мишени для разработки диагностического инструмента для обнаружения нуклеиновых кислот in vitro со специфичностью несоответствия по одному основанию и аттомолярной чувствительностью, демонстрируя широкий спектр потенциальной полезности в диагностических и фундаментальных исследованиях. Приложения [71]. Эти исследования показывают, что Cas13a обладает большим потенциалом для точного, надежного и масштабируемого применения РНК-ориентированного РНК-таргетинга [29]. Вирусы растительной РНК ответственны за значительную долю важных заболеваний растений, поражая широкий спектр видов растений и приводя к серьезным потерям качества и количества в различных ключевых культурах [142, 143]. Различные трансгенные стратегии, основанные на концепции устойчивости к патогенам, были использованы для создания устойчивости к вирусам у многих видов растений [144]. Например, трансгенные растения, экспрессирующие вирусные гены (например было показано, что гены, кодирующие белки вирусной оболочки) или последовательности РНК вирусного происхождения (для индуцирования устойчивости, опосредованной РНК-интерференцией), обеспечивают иммунитет против вирусов, из которых были получены эти гены, а также последовательности РНК [145-147]. Кроме того, введение растительных противовирусных генов, R-генов, в растения получило известность как эффективный подход к созданию трансгенных растений, устойчивых к вирусной инфекции [148-151]. Несмотря на многообещающие результаты, многие недостатки ограничивают применение этих трансгенных подходов в сельском хозяйстве [23, 24, 103]. Потивирусы - это вирусы, патогенные для растений, которые принадлежат к роду Potyvirus, одной из крупнейших групп вирусов растений, помимо бегомовирусов. Потивирусы представляют собой экономически важную группу патогенов, способных наносить серьезный ущерб широкому кругу растений. Представители потивирусов, такие как вирус мозаики репы (TuMV), имеют длинные нитевидные частицы длиной 700-750 нм, содержащие положительно-цепочечный РНК-геном, состоящий примерно из 10 000 нуклеотидов. Геном ssRNA этих вирусов кодирует единственную длинную открытую рамку считывания (ORF), окруженную концевыми нетранслируемыми участками. Геном РНК транслируется в один большой полипротеин, который впоследствии обрабатывается и расщепляется кодируемыми вирусом протеиназами с получением по меньшей мере 10 функциональных белков [152]. В этой работе мы стремились изучить возможность применения системы CRISPR/Cas13a для инженерных помех против РНК-вирусов в растениях. С этой целью мы разработали систему интерференции РНК CRISPR/Cas13a для приложений in planta. Наше исследование показало, что каталитическая активность CRISPR/ Cas13a приводила к интерференции против помеченного GFP вируса TuMV-РНК в переходных анализах и стабильных линиях сверхэкспрессии Nicotiana benthamiana; и что Cas13a может перерабатывать транскрипты пре-crRNA в функциональные crRNA, что приводит к интерференции TuMV. Таким образом, наше исследование продемонстрировало, что система CRISPR / Cas13a переносима на виды растений для РНК-вирусной интерференции, тем самым открывая множество возможностей для исследований и прикладного использования в растениях и других видах эукариот. Результаты CRISPR/Cas13a защищает бактериальные клетки от вторжения РНК-вирусов. Поэтому мы попытались проверить осуществимость и переносимость системы CRISPR/Cas13a для обеспечения молекулярного иммунитета против РНК-вирусов у растений. Мы выбрали вирус мозаики репы potyvirus (TuMV) из семейства Potyviridae в качестве мишени для CRISPR/Cas13a. Рекомбинантный TuMV (TuMV-GFP), меченный GFP, использовали для обеспечения системы легкого мониторинга вирусной инфекции, репликации и распространения, тем самым облегчая оценку интерференционной активности системы CRISPR/Cas13a против вируса TuMV. Чтобы сконструировать растения, экспрессирующие механизм CRISPR/Cas13a, мы оптимизировали нуклеотидную последовательность Cas13a Leptotrichia shahii (LshCas13a, WP_018451595.1) для экспрессии в растениях и специально синтезировали четыре перекрывающихся фрагмента для сборки конструкции, которую мы назвали оптимизированной для растительных кодонов Cas13a (pCas13a). Четыре перекрывающихся фрагмента pCas13a были собраны для получения полноразмерного клона, окруженного сайтами рекомбинации attL1 и attL2, сигналом ядерной локализации, слитым с концом белка, а также слиянием метки 3x-HA на N-конце для облегчения обнаружения белка. Затем pCas13a был субклонирован в целевой бинарный вектор pK2GW7 с помощью реакции рекомбинации Gateway для получения клонов с избыточной экспрессией pK2GW7:pCas13a, управляемых 35S промотором вируса мозаики цветной капусты (CaMV) (рис. 2.1A и рис. S1A). Впоследствии Agrobacterium tumefaciens трансформировали с помощью бинарного клона pCas13a с помощью электропорации. Затем культуры Agrobacterium GV3101, содержащие бинарный клон 35S::pCas13a, использовали для временной экспрессии в листьях N. benthamiana посредством агро-инфекции или для получения трансгенных растений, сверхэкспрессирующих эффекторный белок pCas13a (pCas13a-OE). Мы подтвердили экспрессию pCas13a в переходных анализах в листьях N. benthamina и в постоянных линиях, сверхэкспрессирующих pCas13a. Наши данные вестерн-блоттинга с антителом против HA tag показали, что белок pCas13a экспрессировался в растениях и был обнаружен правильный размер белка (рисунок 2.1, рисунок S1B). Затем, чтобы нацелиться на вирус TuMV-GFP, мы спроектировали и сконструировали различные crRNA, нацеленные на четыре различные области генома TuMV-GFP, включая две мишени в GFP (GFP1 и GFP2), а также последовательности хелперного компонента протеиназы, подавляющего глушение (HC-Pro) и белка оболочки (CP) (рис. 2.1C). Мы сконструировали геном RNA2 вируса табачной гремучести (TRV) для временной и системной экспрессии и продуцирования crRNA под промотором вируса раннего потемнения гороха (PEBV) в табачных растениях, как описано ранее (рис. 2.1D) [153]. Эти crRNAs могут быть использованы для проверки функциональности CRISPR/pCas13a как в переходных, так и в стабильных анализах. Рисунок 2.1: Восстановление механизма CRISPR/Cas13a на растениях. A: Схематическая сборка оптимизированного для растительных кодонов Cas13a (pCas13a). pCas13a был специально синтезирован в виде четырех фрагментов. Фрагменты F1 (с attL1 и 3x-HA), F2, F3 и F4 (с nls и attL2) собирали в клонирующем векторе с использованием системы рестрикционного лигирования. Соответствующие сайты ферментов рестрикции представлены вверху. С помощью реакции LR pCas13a был перемещен в совместимый со шлюзом двоичный вектор pK2GW7, чтобы получить pK2GW7-pCas13a. Метка эпитопа гемагглютинина HA человеческого гриппа, сигнал ядерной локализации nls, attL1 и attL2, сайты рекомбинации клонирования ворот. B: Подтверждение экспрессии pCas13a в трансгенных линиях. Общий белок экстрагировали из трех независимых линий N. benthamiana, трансформированных pK2GW7-pCas13a. Антитело против HA использовали для обнаружения pCas13a, меченного HA. Стрелка указывает на наличие pCas13a. В качестве отрицательного контроля использовали дикий тип (WT). C: Геном TuMV-GFP с выбранными мишенями. Наконечники стрелок указывают на четыре выбранных места. Нижняя панель представляет последовательности РНК-мишеней в паре с их соответствующими crRNA. Место фланкирования протоспейсера PFS. D: Экспрессия crRNA из системы TRV. Последовательности ДНК, направляющие повтор, были клонированы под промотором PEBV в РНК 2 TRV для конститутивной и системной экспрессии. E: Схематическое представление комплекса pCas13–crRNA–мишень. Нацеливающий комплекс pCas13a–crRNA (повторяющаяся последовательность-n28, направляющая РНК-n28) связывается с РНК-мишенью n28 для интерференции. CRISPR/pCas13a интерферирует с TuMV-GFP в planta. Чтобы исследовать, может ли CRISPR/pCas13a нацеливаться на TuMV-GFP и препятствовать ему, мы сначала провели транзиторные анализы на листьях N. benthamiana. Успешное вмешательство в геном TuMV-GFP должно привести к ослаблению репликации и распространению вируса. Это ослабление репликации вируса может быть измерено путем мониторинга уровня и распространения опосредованной вирусом экспрессии GFP в системных листьях во время течения инфекции. Культуры Agrobacterium, несущие бинарные клоны pK2GW7:pCas13a, TRV RNA1 и сконструированный геном TRV RNA2, содержащий crRNA против одной из четырех различных геномных мишеней TuMV-GFP (HC-Pro, белок оболочки (CP), GFP-мишень 1 (GFP1), GFP-мишень 2 (GFP2)), а также поскольку инфекционные клоны TuMV-GFP были совместно доставлены в листья N. benthamiana посредством агро-инфекции. Кроме того, в качестве контроля использовали неспецифическую crRNA (ns-crRNA), не комплементарную геному TuMV-GFP. Интерференционную активность системы CRISPR/pCas13a против вируса TuMV-GFP оценивали через 7 дней после инфильтрации (dpi) путем мониторинга и визуализации сигнала GFP в системных листьях растений под ультрафиолетовым светом. Наблюдалось снижение уровня сигнала GFP на ~50% в системных листьях растений с crRNAs, нацеленных на последовательности HC-Pro и GFP2. Кроме того, низкое, но обнаруживаемое снижение сигнала GFP наблюдалось с CP и GFP1 crRNAs по сравнению с контролем, в то время как никакой разницы в сигнале GFP не наблюдалось в N. растения benthamiana были совместно инфильтрированы TRV, экспрессирующими nscrRNAs, целевые crRNAs и TuMV GFP, но не клонами pK2GW7:pCas13a (рисунок S2A, B). Эти результаты показали функциональность и способность CRISPR/pCas13a вмешиваться в вирус TuMV-GFP в planta. Затем мы оценили интерференционную активность CRISPR/Cas13a против TuMV-GFP в трансгенных растениях N. benthamiana, конститутивно сверхэкспрессирующих белок pCas13a (pCas13a-OE) под контролем промотора CaMV35S. Эти растения, сверхэкспрессирующие pCas13a, были получены путем опосредованной Agrobacterium трансформации клонов pK2GW7:pCas13a в растения N. benthamiana дикого типа, и экспрессия белка pCas13a была подтверждена вестерн-блоттингом (рис. 2.1B). crRNAs, нацеленные на последовательности HC-Pro, CP, GFP1 или GFP2, доставляли в растения pCas13a-OE через систему TRV, как описано выше. Кроме того, растения pCas13-OE были совместно инфильтрированы клонами TuMV-GFP посредством агро-инфекции. Сигналы GFP, экспрессируемые вирусом, отслеживались в системных листьях зараженных растений pCas13a-OE при 7 dpi. Мы наблюдали существенное снижение, до 50%, интенсивности GFP при использовании crRNAs, нацеленных на мишени HC-Pro и GFP2. Однако crRNAs, нацеленные на последовательности CP и GFP1, демонстрировали лишь умеренное снижение интенсивности GFP по сравнению с ns-crRNA или контролем пустого вектора, что согласуется с анализом переходного периода (рис. 2.2A, рис. S3). Мы также провели вестерн-блоттинг для оценки уровня вируса в системных листьях. Мы обнаружили, что растения с crRNAs, нацеленными на последовательности HC-Pro или GFP2, демонстрировали наибольшее снижение уровней GFP по сравнению с crRNAs, нацеленными на последовательности-мишени CP или GFP1, или контрольными, что дополнительно подтверждает результаты, полученные в результате анализа сигналов GFP (рис. 2.2 B). Чтобы дополнительно подтвердить опосредованную CRISPR/pCas13a интерференцию с РНК-геномом TuMV-GFP, был проведен нозерн-блоттинг для оценки накопления генома TuMV. В соответствии с уровнем белка GFP, нозерн-блоты показали существенное снижение накопления генома РНК TuMV-GFP с использованием crRNAs, нацеленных на HC-Pro или GFP2 (рис. 2.2C), что указывает на целенаправленную деградацию геномной РНК TuMV-GFP с помощью CRISPR/pCas13a. Важно отметить, что ns-crRNA не проявляла интерференционной активности, что подтверждает специфичность и программируемость CRISPR/pCas13a для специфического нацеливания на РНК в растениях. жүктеу/скачать 20,66 Kb. Достарыңызбен бөлісу: