Спермий дегеніміз эякуляция кезінде бөлініп шығатын сұйықтық. Спермийлер төрт бөліктен тұрады басы, мойыны, денесі және құйрығы. Спермийлер аналық торша клеткасынан 2 есе кем
жүктеу/скачать 179,18 Kb.
|
Қуат генетика срс
- Бұл бет үшін навигация:
- 2.3. ДНҚ фрагментациясын анықтау
| Сурет – 1. Аталық бұқалардың спермийлеріндегі протамин мен гистон мөлшерін «Aniline Blue» бояуы көмегімен анықтау, алқызыл түске боялғандары пісіп жетілген спермийлер, 100 есе ұлғайту.
Аталған әдіс ябролық белокты анықтау спермийдегі физиологиялық жетілгендерін анықтап, ұрықтың ұрықтандыруға дайындығын анықтауға мүмкіндік береді. Себебі, спермийдің ұрықтандыруға дайындығы ондағы ядролық белоктың, яғни протамин мен гистон мөлшерінің ұлғаюы спермийлер әлі жетілмеген, ұрықтандыруға жағдайы жоқ екеніін көрсетеді. Спермийлердегі ДНҚ хроматинмен жабылған және спермийлердегі гистон деңгейін арттыру хроматиннің бірізділігінің жарылуына және ДНҚ фрагменттеуіне әкеліп соғады. Жұмыс кезінде бұқалар мен еркектердің фертильділігі мен субфертильділігі идентификациясын саралау үшін спермиді бағалайтын тура және кері әдістер бар. Олар кері әдістер SCSA (сперматозоид хроматинінің структуралық анализі), акридин сарғышымен бояу әдістері жатса, тура әдістерге COMET, SCD (Sperm chromatin dispersion,), HALO, AOT (Acridine orange test), TUNEL сияқты коммерциялық потенциалдық әдістер қолданылады. COMET, SCSA әістері сперматозоидтағы ДНҚ дефектін (ауытқуын) анықтау үшін қолданылатын заманауи әдістер болып саналады. SCSA әдісінің негізгі мағынасы аққан цитометри арқылы хроматин жағдайы мен ДНҚ спермиінің бүтіндігін, боялған ДНҚ (акридинді бояумен) лазерлік сәуле арқылы лазерлік жарыққа өтіп, бояу флуросцентті жарықпен түсті анықтауға қолданылады. 1998 жылы COMET және 2003жылы SCD (Sperm chromatin dispersion) жасалған тес системалар жай болы саналады, яғни ол цитометрді қажет етпейді, жарық микроскоп қолданылып 50-200 сперми бір анализге жіберіледі. Бірақ алынған статистикалық мәліметтер дәл болмауы мүмкін. Айта кету керек аталған әдістер SCSA (сперматозоид хроматинінің структуралық анализі), акридин сарғышымен боя әдістері, COMET, SCD (Sperm chromatin dispersion,), HALO, AOT (Acridine orange test), TUNEL әдістері сезімтал, арнайы, хроматин жағдайын және спермилердің ДНҚ фрагментациясын анықтауға мүмкіндік береді. 2.3. ДНҚ фрагментациясын анықтау. ДНҚ фрагментациясы – спермийлердің ұрықтандыру қабылетін бағалайтын көрсеткіш, аталық жануарлардың және олардың спермийлерінің ұрықтандыру қабылетін көрсететін аса маңызды бағалау. ДНҚ молекуласының хроматинінің бүтіндігі ұрықтану кезінде генетикалық материалдарды беруде аса маңызды көрсеткіш. Мұндай зақымданулар көп болған сайын генетикалық материалдың бүтінділігі төмен болып, ұрықтандыру қабілеті нашарлайды.ДНҚ фрагментациясының болу себебі – түзілу кезіндегі ауытқу және сперматозоиттың ескіруі, апаптоз. 30% аталық малдың бедеулігі ДНҚ фрагментация әсерінен болады. ДНҚ фрагментациясы спермилерге қалай әсер етеді? Жұмыртқалықты ұрықтандыру қабілеті төмендейі, ұрықтансада түсік тасталады, қолдан ұрықтандырғанда төл дамуында ауытқу болады. ДНҚ фрагментациясын анықтау үшін қатырылған 100мл спермиге 400мкл физиологиялық ерітінді қосып 2-3минут 2000 айналымда центрифугалаймыз. Осындай әдіспен спермиді сұйылтамыз, себебі соңғы концентрация 1ми спермиде 40-60млн спермиді құрауы үшін. Содан соң 5 мл сұйықты төгіп тастап, микропипетка көмегімен 5мкл сұйықты шыны әйнекшеге салып, 5-7минут ауада кептірірп жағынды жасадық. Заттық әйнекшені горизонтальды жағдайда қойып, жаындыға 1мл фиксирленген ерітінді қосамыз. 5минут өткеннен кейін фиксирленген ерітіндіні төгіп тастап, вертикальдық жағдайдда ұстап дистилденген суда бекіткіштен шаямыз. Ауада жағындыны кептіріп 5мин №1 бояумен 1мл мөлшерде бояймыз, ол жағындыны толық жауып тұруы керек. Содан соң жағындыны стақанда дистилденген суда бояғыштан шаямыз ауада кептіріп, осы процеураны №2 бояғышпен 2минуттық экспозиицияда жасаймыз. ДНҚ фагментациясы дәрежесі протокол бойынша жүргізіледі. Агарозалы пробирканы 15-20минут су монасына (+70°) қойып, одан кейін пробирканы 5минут +37°С термостатқа қоямыз, параллельді түрде сперми үлгісін жасап концентрациясын 10-15млн спермиге 1мл физиологиялық ерітінді қосу арқылы 600мкл сперми қосып жеткіземіз де термостатқа қойып пипетка көмегімен 15-20 тамшы агарозалы сперми қосындысын заттық әйнекшеге орналастырып, көпіршіктер пайда болмас үшін тоңазытқышқа 5 минут қою қажет. Уақыт өткен соң байыппен бетіндегі шыныны алу керек. Заттық шыныға 8-10мл 1 реагент қосамыз 7минут экспозицияда. 1 реагентті төгіп тастап фильтірлік қағазбен заттық шыныны кептіреміз де лотокқа орналастырамыз да 20минут экпозицияда 8-10мл 2 реагентті қосып, реагентті төгіп тастаймыз да дистильденген суда шаямыз. Содан соң горизонтальды жағдайда хаттық шыныны қойып2минуттық экспозицияда 1мл 70% этил спиртін қосамыз да төгіп тастап осы жағдайда процедураны 96%, 100% этил спиртімен қайталаймыз. Заттық әнекшеге 500мкл №1 бояу құйып 2 минут ұстаймыз да жағындыға 1 мл №2 бояуды қосып 10-15 минут ұстап тұрамыз. Жағындыны 7-10 минут ауада кептіріп кептіреміз. Спермилер санын анықтап формула арқылы спермидің протаминмен проценттік көрсеткішін анықтаймыз, гистоны бар жетілген спермилерлер мен жетілмеген спермилер анықталады. Зерттеу нәтижелері және оларды талқылау. ДНҚ фрагментациясының дәрежесін микроскоппен иммерсиялық май көмегімен 40х көрсеткішімен қараймыз. Спермилерді микроскопиялау кезінде 3 топқа бөліп қарастырамыз: ДНҚ фрагментациясынсыз спермилер ( / ≤1,4), ДНҚ фрагментациясымен сперми ( / =1-ден 1,4-ке дейін) және дегенерирленген сперми ( / ≥1,0) деп бөліп қарастырамыз. (сурет – 2) жүктеу/скачать 179,18 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|