Спермий дегеніміз эякуляция кезінде бөлініп шығатын сұйықтық. Спермийлер төрт бөліктен тұрады басы, мойыны, денесі және құйрығы. Спермийлер аналық торша клеткасынан 2 есе кем
жүктеу/скачать 179,18 Kb.
|
Қуат генетика срс
- Бұл бет үшін навигация:
- Хроматиннің жалпы санын анықтау.
| Сурет - 2. 1. фрагментациясынсыз спермилер ( / ≤1,4), 2. ДНҚ фрагментациясымен сперми ( / =1-ден 1,4-ке дейін) 3. дегенерирленген сперми ( / ≥1,0)
2.4. Спермидегі хроматин жағдайын бағалау. Хроматин доминирлеуші және аяқтаушы мағынаны беретін структура. Ол биологиялық толықтылық сақталуын, ұрықтану орнына жетуін, ондағы ДНҚ-ның болуын қамтаасыз етеді. Хроматин жағдайы геномдардың функциональдық белсенділігімен ондығы жатқан механизмдермен байланысты. Сперматогенез түзілуі нәтижесі әлі биологиялық жетілмеген және ооцитті ұрықтандыруға қабілетсіз болып келеді. Оның соңғы жетілуі эпидимис каналының қозғалып, пісіп-жетілуімен, түзусызықты-поступатальды ұрықтандыру қозғалысымен аяұталады. Жетілген спермилер структурасы мен функциясының өзгерісі плазматикалық мембрана, протоплазма және бастысы ядролық материалмен байланысты. Хроматиннің жалпы санын анықтау. (Фельген реакциясы). Фельген реакциясын қолдану – классикалық стехиометрлік әдіспен ядро клеткасындағы хроматин қолдану ретінде белгілі. Шифф реакциясының (фуксин мен сернис қышқылының басты комплексі) альгедин тобынағы дезоксирибозы мен байланысты болып, тұз қышқылының гидролизімен, ДНҚ фуксин пупурлік түсті комплекс түзілуінен кейін қол жетімді болды. Боялған материалдың және ДНҚ сперматозиодының алынған нәтижелері толық бағалауға нәтиже береді. Сурет – 3. Сперматозоидымен Фильген реакциясы. А- жаңа алынған шәует, Б – 6 тәулік бөлме темперетурасында сақталан шәует (қозғалғытығы 0 балл). Оң және сол жақтағы классикалық және флеуресценттік үлгіге сай. Классикалық флуресцентті варианттан басқа, Фельген оң флуросцентті комплекс бар (сурет-3). Бұрынғы Фельген-оң тест материалдары бүұалардың ертильділігін анықтауда теріс нәтиже берді. Фельген-оң материалы сперматазоидта ұрықтағы гамета саны және 6-тәуліктен бөлме темпиратурасында кейін өлген сператозоидтар анықталмады. Ұрық сақталуынан 1 тәуліктен кейін көп клеткалар жаңа алынған ұрық клеткасы ДНҚ – дағыдай, сондай-ақ тірі және ұрықтандыруға қабілетті спермилер қысқарған. 1-3 тәуліктен кейін өлі спермилер ДНҚ саны көбейген.( қисық Гаусс модасы төменгі мағынаға дейін). Осындай бұзылған хроматин саны бар спермилер бірден азаяды. ДНҚ денатурациясы кезінде хроматин тұрақтылығын бағалау. (SCSA – sperm chromatin structure assay). Аталған әдісті алғаш рет D.P.Evenson ұсынған. Оның негізгі мақсаты денатурация кезінде сперматозоид ДНҚ тұрақтылығын анықтауға негізделген. Изолирленгн ядро клеткасын 5 минут бойы 100°С температурада қыздыып, ДНҚ жүзуін қамтамасыз етеміз. Сарғылт акридин бояуымен бояғаннан кейін алынған жарық құрамында екі спиральдық ДНҚ-сы бар ядро жасыл түсті жаарықпен жанады (ұзындығы 540 нм), ал ядрода ДНҚ-сы денатурацияланған бір спиральды толқын қызыл түске боялады (ұзындығы 600 нм). Ядролардың ұзындығы микрофлуориметрдің праграммалық есептеуімен, ядролардың денатурацияланған және денатурацияланбаған ДНҚ автоматты түрде есептеуге мүмкіндік береді. SCSA зерттеу әдісі хроматин структурасын қартайан сайыны өзгерісін бақылап, алынған нәтижелер ұрықтандыру кезінде жақсы нәтиже береді. Хроматин структурасында аномаллия болуы мен күйіп қалған спермилер арасында корреляциялық байланыс бар. SCSA әдісінің тағы бір варианты бар, ол ДНҚ денатурациясын спериді алмай бүтіндей денатурациясын анықтау. Алынған сперми жағындысын қышқылмен өңдеп, акридин сарғылымен бояу керек. Денатурацияланған және денатурацияланбаған спермилер санын люминесцентті микроскоп астында қызыл және жасыл түспен жанып тұрған гаметалардың санын анықтап анықтайды. Яғни микрофлуориметрді қолданбай-ақ. Кейбір жағдайларда ядро сарық жарық береді (қызыл мен жасыл түс арасынддағы). Бұл анализдің артықшылығы люменисцентті микроскоп қолдану арқылы, микрофлуориметрді қолданып қымбатқпа түспеу. Бірақ та бұл әдіс ұзақ уақыт алады және зерттеуге алынып жатқан сперми саны 100 есе көп кетіп, алынған нәтиженің дәлдігіне күмән келтіреді. SCSA әдісі арқылы алынған нәтижелерде қызыл түс берген сперматазоид ядросының бөлігі денатуацияға сеззімталдығы жоғары, ДНҚ молекуласының үзілуімен, ДНҚ фрагментация индексінің көрсеткішін білдіреді. ДНҚ спермиінің денатурацияға сезімталдығынан бөлек SCSA әдісі, хроматин жеткіліксіз жетілмеген спермилерді ажыратып балауға мүмкіндік береді. Жетілмен хроматин ДНҚ-ны әлсіз экрандайды, акриднмен бояғанда аз қорғаныш бергені әсеріненжетілмеген спермилер жетілген спермилер интенсивтілігіне қарағанда 5 есе мықты. Бұл көрсеткіш HDS (high level of DNA satibility) білдіреді. ДНҚ үзігін анықтау (TUNEL әдісі). Спермилердегі ДНҚ бұзылуы хромосомалардың үзілуімен сипат алады. Ол молекула нуклеопротеидінде протамин бұзылуымен байланысты. Мұндай үзілулерді анықтау үшін хромицин А3 және флуолесцеинизотицианат нәтижелі қолданылады. Бірақ бұл әдістерге қарағанда сенімді әдіс бар ол - TUNEL әдісі. Люменисцент интенсивтілігі флруреосцентті меткалармен ДНҚ үзілуіне пропорцианальды. Флуреохрома ретіне флуоресцеин қолданылып, ол TUNEL-позитивті клеткалардың пайзын анықтауға мүмкіндік береді. жүктеу/скачать 179,18 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|