Тұқым қуалайтын ауруларға диагноз қою әдістері тақырыбы бойынша ақпараттық-дидактикалық блок

Цитогенетикалық экспресс-әдiстерi

жүктеу/скачать 230,5 Kb. бет 7/12 Дата 11.09.2024 өлшемі 230,5 Kb. #204189

Бұл бет үшін навигация:

• Х- және У-хроматиндi экспресс-анықтау
• Тікелей ДНҚ диагностикасы
• ДНҚ (немесе РНҚ) кесiндiлерiн алу
• ДНҚ-ны кесінділерге бөлшектеу (рестрикция)
• . ДНҚ кесiндiлерiн электрофорездеу
• Гельдегi кесiндiлердi анықтау
• . ДНҚ кесiндiлерiн идентификациялау (танып ажырату)

Цитогенетикалық экспресс-әдiстерi – тез, арзан және жеңіл орындалатын бастапқы диагностикалау әдістері. Бұл әдістерде аз мөлшерде оңай алынатын материалдар (қан, зәр) қолданылады. Х- және У-хроматиндi экспресс-анықтау - жынысы мен жыныс хромосомалардың санының өзгеруін анықтауға мүмкіндік береді. Жиі ұрттың кілегей қабатының жасушаларының (буккальды эпителий) қырындысын алу және оларды бояп микроскоппен зерттеу арқылы жүргiзiледi. Бұл әдiс Барр денешiгiнiң саны арқылы (Х-хромосомалар санынан біреуі артық болады) кариотиптегi Х-хромосомалардың санын анықтауға мүмкiндiк бередi. Барр денешiгi дегенiмiз - әйелдердің 5-60%, ер адамдардың 2-5% қалыпты жасушаларының ядролық мембранасының астында сопақша денешiк болып анықталатын, активсiзделген Х-хромосоманың бiреуi (3 сурет, а). У-хроматиндi анықтау үшiн жағындыларды 0,005% акрихин-иприт ерiтiндiсiмен бояп люминесценттi микроскоппен қарайды. У- хромосома жарық көк нүкте түрде көрiнiс берiп, оның кариотиптегi санын анықтауға мүмкiндiк бередi (3 сурет, в,г). Қан жағындыларында жыныс Х-хроматинін нейтрофилді жасушаларды ядросында дабыл таяқшасы тәрізді өсінділерді (активсізделген Х-хромосомасы) санау арқылы да анықтауға болады (“дабыл таяқшасы” әдісі). Молекулалық-генетикалық әдiстер - бұл ДНҚ қүрылысындағы түрлi өзгерiстердi, тіпті бірінші реттік нуклеотидттiк қатарына дейiн анықтауға мүмкiндiк беретiн әр түрлi әдiстердiң үлкен тобы. Тікелей ДНҚ диагностикасы-бұл диагностика зерттелетін гендегі мутацияны тікелей анықтауды қамтиды. Жанама ДНҚ диагностикасы. «Жанама» ДНҚ диагностикасы хромосомада ген картағаланған, яғни белгілі бір хромосоманың белгілі бір кіші аймағында локализацияланған ауруларда қолданылады. Әдістің мәні ауру генімен байланысты полиморфты генетикалық маркерлердің ауру және сау отбасы мүшелеріндегі тұқым қуалаушылықты талдау болып табылады. Мұндай маркерлер аллельдік нұсқалар түрінде болатын және құрылымы бойынша әр түрлі адамдар арасында ерекшеленетін ДНҚ аймақтары болып табылады. Осының арқасында пациенттің ДНҚ-сын талдау кезінде белгілі бір маркер нұсқасының аналық және әкелік шығу тегін ажыратуға болады. Маркер патологиялық генге жақын орналасқан, сондықтан кроссинговерден кейін маркер мен ауру гені бір хромосома сегментінде қалады және ұрпаққа бірлік ретінде беріледі. Талдаудың арқасында ұрпақтар қатарында әр ата-анадан алынған хромосомаларды анықтауға болады. Молекулалық-генетикалық әдiстердiң негiзгi кезеңдері мен түрлерi: 1. ДНҚ (немесе РНҚ) кесiндiлерiн алу барлық әдiстердiң бастапқы кезеңі. ДНҚ-ны барлық ядролы жасушалардан алуға болады: перифериялық қан лейкоциттерi, хорион, амнион жасушалары, фибробласттар, ұрттың клегей қабығының қырындысы, бiрнеше шаш баданасы және т.б. Бүл аз мөлшердегі материалды қолдануға болады. Алынған ДНҚ-ны барлық әдiстерге пайдалануға болады және тоңазытылған түрiнде көп мерзiмде сақталады. Жиi, ауруды немесе гетерозиготалы тасмалдаушылықты табысты диагностикалау үшiн қысқа ДНҚ кесiндiсiлерi(фрагменттері) жеткiлiктi болады. Керектi кесiндiнi көп мөлшерде көбейтiп (амплификациялап) алу полимеразалық тiзбектiк реакция (ПТР) арқылы жүргізіледі. ПТР дегенiмiз - бүл in-vitro жағдайында ДНҚ-ны амплификациялау әдiсi. Ол үшiн кесiндiнiң нуклеотидтiк ретін бiлiп, сол арқылы екi олигонуклеотидтiк праймер (бастауыш) синтездеу керек. Амплификациялау процессi үш сатыдан тұрады: - ДНҚ-ны қыздыру арқылы денатурациялау (ДНҚ-ның екі тізбегін бірі бірінен ажырату)  праймерлердiң бiр тiзбектiк молекулалардың комплементарлық бөлiктерiмен байланыстыру (жасыту)  байланысқан праймерлер аралығында полимераза арқылы полинуклеотидтiк тiзбектердi синтездеу (4 сурет). Осы циклды бiрнеше рет қайталау арқылы белгiлi ДНҚ бөлiгiн миллион, немесе одан да көп рет көбейтуге болады. 2. ДНҚ-ны кесінділерге бөлшектеу (рестрикция) молекулалық диагностикалауда керектi кезең. Бүл кезең бактериялық эндонуклеазалар тобына жататын рестриктаза ферменттер арқылы жүргiзiледi. Адам генетикасында екi тiзбектiк ДНҚ-ны 4-6 жұп негiздерден тұратын нуклеотидтiк ретті белгілі бір аймақтарда кесетiн оншақты әр түрлi рестриктазалар қолданылады. Әр түрлi рестриктазалар әр түрлi тiзбектердi таниды, яғни олардың рестрикция сайттары әртүрлі болады. Соған байланысты, рестриктазаның әр түрiне сай, әртүрлі ұзындықты ДНҚ-ның кесiндiлерi пайда болады. Рестриктивті кесінділердің ұзындығының полиморфизмі (РКҰП) әдісі әртүрлі ағзалардың туыстық дәрежесін анықтау үшін кеңінен қолданылады (5 сурет). 3. ДНҚ кесiндiлерiн электрофорездеу - агарлық немесе полиакриламидтiк гельдiң бетiнде ДНҚ кесiндiлерінің мөлшері бойынша орналасуын қамтамасыз етеді. ДНҚ кесiндiлері мөлшеріне байланысты тұрақты электр өрісінде жылдамдылықпен теріс полюсiнен оң полюсiне қарай жылжиды. Әр бөлiктiң ұзындығын, оның өткен жолын мөлшері белгiлi ДНҚ стандартты үлгісінің өткен жолымен салыстыру арқылы бiлуге болады. 4. Гельдегi кесiндiлердi анықтау диагностикалаудың соңғы, немесе әрі қарай талдаудың кажеттi кезеңі. Гельдi ДНҚ-мен байланысатын этидий бромидiмен өңдейді. Ультракүлгін сәуле арқылы қарағанда гельдiң бетiнде олар қызыл түстi жарық көзі болып көрiнедi. Нәтижелердi автоматты түрде тiркеуге мүмкiндiк беретiн фрагменттердi бояудың басқада әдiстерi бар. 5. ДНҚ кесiндiлерiн идентификациялау (танып ажырату) - арнайы (керектi) кесiндiлердi гельден табу, қазiргi кезде жиi Саузерннің блот-будандастыру әдiсi арқылы жүргiзiледi (6 сурет). Керекті фрагмент белгілі нуклеотидтік тізбектен және осы кесіндімен комплементарлы байланысатын арнайы зонд көмегімен анықталады. жүктеу/скачать 230,5 Kb. Достарыңызбен бөлісу: