Қазақстан республикасы ауыл
УДК 636.09:579.861.2(043.2)
жүктеу/скачать 5,46 Mb. Pdf көрінісі
|
СЧ 2023 том 1 часть 2
| УДК 636.09:579.861.2(043.2)
ТЕХНОЛОГИЯ ДЕТЕКЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ МАСТИТА КРС STAPHYLOCOCCUS AUREUS НА ОСНОВЕ ИЗОТЕРМИЧЕСКОЙ АМПЛИФИКАЦИИ Зейнулин М.Қ. магистрант I курса Казахский агротехнический исследовательский университет им. С. Сейфуллина г. Астана Мастит – это заболевание вымени и молочных желез, характеризующееся патологи- ческими изменениями в области секрета и ткани молочных желез. Субклинический ма- стит – вид мастита, при котором внешние признаки заболевания выражены слабо или полностью отсутствуют. При подобных случаях заболевания патологические процессы в молочных железах происходят слабее. В редких случаях они могут вызывать уплотне- ния ткани вымени, но чаще подверженные заболеванию области уменьшаются в объеме с пониженным тургором ткани. Качество производимого молока у пораженных коров изменяется, а также понижается его количество. Диагностика субклинических маститов основывается на обнаружении данных изменений [1]. Возбудителями мастита у крупного рогатого скота могут являться как организмы бак- териального ( Staphylococcus aureus, spp; Streptococcus uberis, agalactiae, dysgalactiae; Escherichia coli; Mycoplasma spp и др.), так и грибного происхождения (Aspergillus spp; Candida; Cryptococcus neoformans). У заболевшего поголовья скота выявляются нетипич- ные показатели производимого молока. Другим признаком является повышение сомати- ческих клеток в количестве. Лечение антибиотиками вызывается благоприятный эффект при заболевании грамположительными организмами. Вызванные микоплазмами симпто- мы особенны тем, что происходит одновременное поражение нескольких четвертей вы- мени животного, а также отеки суставов. Антибиотикотерапия слабо эффективна в отно- шении большинства патогенных микоплазмов. Лечение может отсутствовать в случаях заражения распространенным возбудителем мастита M. Bovis [2]. Золотистый стафилококк (лат. Staphylococcus aureus ) на сегодняшний день является возбудителем опасных заболеваний как животных так и человека. Данный микроорга- низм может быть обнаружен во внешней среде, а также способен заражать ткани молоч- ных желез животных. Золотистый стафилококк является одним из основных возбудите- лей мастита у коров. Потребление зараженных продуктов может вызвать пищевые отправления человека, которые обусловлены присутствием энтеротоксинов вырабатываемых стафилококками при определенных условиях. Заболевания при данных инфекциях происходят при потре- блении мясных, молочных и иных продуктов. Однако в большинстве случаев отравления происходят при употреблении молочных продуктов [3]. Наряду с детекцией золотистого стафилококка в пищевых продуктах, немаловажной ролью играет его выявление в молоке на фермах при диагностике мастита у животных. Подобного рода проблемы требуют больших исследований в области обнаружения дан- ного микроорганизма. На сегодняшний день существуют разные методы детекции зо- лотистого стафилококка. Они основаны на применении бактериологических, серологи- ческих методов или на современных методах диагностики. Минусом данных методов является длительное время необходимое для получения результата. Наиболее быстрыми и чувствительными методами являются методы основанные на диагностике ДНК патоге- на. Отличительной особенностью данного метода является возможность проведения ана- лиза, в присутствии других организмов без предварительного обогащения материала [4]. 219 Изотермическая амплификация - это новый метод амплификации ДНК при посто- янной температуре, обеспечивающий простые, быстрые и экономически эффективные методы обнаружения биологических мишеней, особенно для несильно оборудованных лабораторий, а также для обнаружения в полевых условиях [5]. Изотермические техноло- гии в основном включают петлевую изотермическую амплификацию (LAMP), амплифи- кацию со смещением нити (SDA), амплификацию с множественным смещением (MDA), амплификацию по вращающемуся кругу (RCA), изотермическую геликазозависимую амплификацию (HDA) и рекомбиназную полимеразную амплификацию (RPA) [6,7]. Молекулярные методы, такие как обычная полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ПЦР в реальном времени, использовались для быстрой идентификации большинства па- тогенов, включая S. aureus. Анализ петлевой изотермической амплификации (англ. Loop mediated isothermal amplification, LAMP) был впервые опубликован Notomi et al. [8]. Это метод амплификации ДНК с высокой специфичностью и чувствительностью, который может быть проведен в изотермических условиях с диапазоном температур от 60 до 75 °C в течение 1 часа. Методология LAMP требует четырех (F3, B3, FIP и BIP) или шести оли- гонуклеотидных праймеров (F3, B3, FIP, BIP, LoopF и LoopB) для распознавания шести- восьми различных областей в гене-мишени. В настоящее время анализы LAMP широко используются для выявления вирусных, бактериальных и паразитарных патогенов. Бак- териальные идентификационные тесты, основанные на технологии LAMP, уже доступны для широкого спектра бактерий, включая Arcanobacterium pluranimalium, Campylobacter jejuni и Campylobacter coli, Mycobacterium tuberculosis и Vibrio parahaemolyticus [9,10]. В настоящее время рекомбиназная полимеразная амплификация (англ. Recombinase Polymerase Amplification, RPA, РПА) является самым быстрым методом амплификации, который может быть легко адаптирован для использования в устройствах для тестиро- вания на месте. Технология RPA обеспечивает умножение генетического материала ме- нее чем за 15 минут, а сама реакция осуществляется в изотермических условиях. При добавлении обратной транскриптазы к реакционной смеси посредством РПА возможно определять РНК, так же как и ДНК, без необходимости в отдельной процедуре получения кДНК. Поскольку реакция может быть проведена при температуре от 37 до 42 °C в те- чение 20 мин, она считается наиболее близкой к так называемой изотермической ампли- фикации. В последние годы RPA использовался для быстрого обнаружения в областях медицины человека и ветеринарии, пищевой промышленности и сельского хозяйства. Продукты RPA можно визуализировать с помощью различных методов обнаружения, та- ких как электрофорез в агарозном геле, количественная флуоресценция в реальном вре- мени и полоски с боковым потоком [7, 11]. Системы на основе коротких палиндромных локусов CRISPRи кластера генов Cas уже давно стали известны людям. На сегодня они применяются в разных целях. Изначально они были найдены у бактерий, в последующем они были выявлены и у других микро- организмов. Во время работы с CRISPR/Cas исследователь способен создавать единые гидовые РНК в которые способен задавать необходимую последовательность элемен- тов, для возможности в последующем обнаруживать и влиять на определенные мишени. Это стало причиной их широкого интереса среди исследователей. Применение данных систем в диагностике инфекционных заболеваний считается наиболее перспективным на сегодняшний день. Применение CRISPR/Cas в диагностике способно обнаруживать низкие концентрации опасных возбудителей за счет считывания их нуклеотидных после- довательностей. Данный метод является точным, быстрым и простым в использовании. Для работы не требуется дорогостоящее оборудование по причине наличия методов бы- строй подготовки проб и применения современных методов амплификации [12]. Современные методы обнаружения нуклеиновых кислот в низких концентрациях имеют значимое место в развитии детекции патогенных организмов способных вызывать заболевания животных и людей. Молекулярные анализы, основанные на полимеразной 220 цепной реакции, не могут быть применены в полевых условиях или в ограниченных ус- ловиях в связи с необходимостью сложного оборудования. По этой причине интерес к дешевым, но в то же время не менее эффективным методам выявления патогенов растет с каждым годом. Изотермические методы детекции генного материала на сегодняшний день наряду с ПЦР применяются в лабораториях и облегчают амплификацию некоторых нуклеиновых кислот. Сравнивая петлевую изотермическую амплификацию и рекомбиназную полимераз- ную амплификацию можно прийти к заключению, что оба метода имеют свои преиму- щества при работе в разных условиях и для достижения разных целей. На основе дан- ных технологий разработаны тест-системы для различных распространённых патогенов бактериального и вирусного происхождения. Преимущества методов - это прежде всего простота в применении и высокая специфичность, а также дешевизна, высокая скорость и лёгкость визуализации результатов анализа. Анализ данных литературы говорит о требовании дальнейшего детального изучения применения изотермических методов амплификации в лабораторной диагностике. Усо- вершенствование методов детекции необходимо для разработки на их основе более чув- ствительных и эффективных методов диагностики, для применения на практике [13]. Данное исследование было профинансировано Министерством сельского хозяйства Республики Казахстан (BR10764944). жүктеу/скачать 5,46 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|