Қазақстан республикасы ауыл
НОВЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ
жүктеу/скачать 5,46 Mb. Pdf көрінісі
|
СЧ 2023 том 1 часть 2
| НОВЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ
КОРМОВЫХ ФЕРМЕНТОВ Соничев Б.Е., соискатель к.б.н. ООО «Биохем Рус», исп. директор г. Москва На сегодняшний день не существует единого общепризнанного и стандартного ме- тода определения активности ферментов, разрушающих некрахмалистые полисахариды (НПС). Каждый производитель НПС-ферментов использует собственный подход, а так- же свои аналитические условия (рН, температура, субстрат и т.д.). На практике опреде- ление активности фермента показывает активность конкретного фермента, входящего в состав коммерческого продукта. Это создает трудности для потребителей в ориентиро- вании и сравнении этого разнообразия доступных продуктов на рынке. В данной работе НИЦ «Черкизово» предложил использовать понятие «эффективность фермента» и разра- ботал новый метод его анализа. Было продемонстрировано, что конечный продукт фер- ментативной реакции может выступать в качестве рабочего индикатора эффективности фермента. В результате было показано, что различные ферментные комплексы способ- ствуют различному выделению свободных простых сахаров в водном коллоидном рас- творе измельченного зерна, инкубированном при температуре 39°С с эффективностью от 6 до 160% к контролю. Например, в пшенице увеличение высвобождения сахаров (т.е. эффективность работы мультиэнзимных смесей) колеблется от 22 до 76%, в ячмене – от 11 до 160%, в кукурузе - от 6 до 74%, в зерносмеси – от 18 до 60%. Авторы демонстри- руют простой способ оценки эффективности ферментов и предлагают использовать его в качестве предварительного результата при оценке возможности подбора эффективной мультиэнзимной композиции для конкретного рациона и конкретного кормового сырья, в т.ч. нетрадиционного. Это позволит проводить предварительную оценку эффективности работы кормовых ферментов для конкретного сырья и рационов. В настоящее время добавление кормовых ферментов при составлении рационов стало обыденным делом. Ферменты, направленные на разрушение некрахмалистых полисаха- ридов (НПС): ксиланаза, глюканаза и целлюлаза. Они по частоте использования занима- ют второе место в мире и первое место в России после фитазы. В то же время применя- ются ферменты: протеаза, маннаназа, пектиназа, амилаза, галактозидаза и др. В связи с широким применением ферментов, рынок производства кормов требует до- ступные, информативные и валидированные методы оценки ферментов, как в товарном продукте, так в премиксах и комбикормах. Такое рутинное исследование по определению активности ферментов должно было стать существенным шагом в контроле использова- ния ферментов, качества их производства и применения [1]. Сегодня не существует единого стандартного метода для определения активности ферментов, разрушающих НПС. Каждый производитель НПС-ферментов использует свой собственный подход, а также свои собственные условия анализа (рН, температуру, субстрат и т.д.). Поэтому каждый производитель дает свое собственное понятие единицы активности НПС-ферментов [2]. Уровень активности ферментных препаратов является наиболее важным критерием, определяющим их жизнеспособность. Исходя из величины ферментативной активности (или соотношения разных активностей), осуществляется подбор препарата и его дози- ровка. Методики определения активности в разных исследовательских лабораториях, компаниях, странах существенно отличаются друг от друга [3]. 299 Наличие большого разнообразия единиц активности ферментов, которые применя- ют разные производители, обусловлен, прежде всего, тем, что каждому производителю удобно применять «свою» единицу активности для стандартизации своих ферментов при производстве. Проблемы для потребителя заключаются в сложности ориентирования в этом много- образии предлагаемых рынком препаратов и часто в невозможности их сравнения. Про- изводители указывают специфические активности ферментов, как правило, руководству- ясь своими понятиями о единицах активности и методах их определения. В результате предлагаемый достаточно дорогостоящий анализ активности не обеспечивает сравнимо- сти результатов. В результате, потребителю остается ориентироваться на рекомендуемые в инструк- циях по применению нормы ввода, которые предлагается принимать на веру [3,4,5, 7]. На практике мы видим, что определение активности ферментов показывает нам актив- ность того или иного энзима, входящего в коммерческий продукт. Эта активность гово- рит о «живучести» фермента [8]. Надо обратиться к возможности определить количество конечного продукта, который накапливается в результате реакции «фермент-субстрат»? Продукт реакции, т.е. моносахарид, который, как правило, является редуцирующим (восстанавливающим), можно определить несколькими способами. Одним из общепри- нятых способов является метод с ДНС-реактивом (3,5-динитросалициловая кислота) [6,9,11]. В результате, конечные потребители – производители мяса птицы и яйца, вынуждены проводить производственные испытания для подбора наиболее эффективного продукта на рынке, который бы удовлетворял их требования по цене и окупаемости затрат на него. Эти производственные испытания связаны с финансовыми и трудовыми затратами, от- влекая ресурсы предприятия на побочную деятельность, которая не связана с производ- ством. Сегодня специалисты не могу полагаться на определение активности ферментов и эта ситуация предполагает проведение предварительных производственных испытаний любого ферментного продукта, ранее не применяемого на данном предприятии, либо по- лагаться на рекомендации коллег и применять, полагаясь на веру. Это утверждение не ка- сается кормовых фитаз в силу ряда причин, которые в этой работе мы не рассматриваем. Мы в этой работе предлагаем выделить понятие «активность» и «эффективность». Активность - это работа фермента в «рафинированных» условиях при определенной температуре, рН, в установленном интервале времени и с химически чистым субстра- том (зачастую условия которых далеки от условий в ЖКТ), которая показывает качество или, так сказать, его жизнеспособность с учетом срока годности, термостабильности и стабильности при хранении. Эффективность – это результат работы фермента по вы- свобождению свободных сахаров (энергии) в «полевых» условиях из субстрата, которым являются любое кормовое сырье или комбикорм. В результате проведенной работы нами сделаны следующие выводы: 1. Указан способ изменения рН буферных растворов в виде имитации перемещения химуса в разные отделы желудочно-кишечного тракта. 2. В работе использован известный классический метод с использованием ДНС-реактива (восстановление 3,5-динитросалициловой кислоты до 3-амино-5- нитросалициловой кислоты под действием восстанавливающих сахаров, имеющей крас- но-оранжевую окраску, интенсивность окраски мы определяли спектрофотометрически при длине волны 540 нм. 3. Использованы единицы оптической плотности окраски реагента в надосадочной жидкости. ДНС-реактив рассчитывали по градуировочному графику, построенному для глюкозы [6,11]. 300 4. Анализ имитирует пищеварение, т.к. рН 4 является более распространенным рН в зобе и железистом желудке, учитывая буферную способность корма повышать рН (още- лачивание), а рН 6,9 является более распространенным рН в тонком кишечнике. Под- робнее об обзоре данных рН в различных отделах кишечника птицы, приведены у M. Bedford, G. Partridge [8]. Мы взяли средние цифры рН приведенных значений. 5. Основная цель - получить в испытаниях in vitro все редуцирующие сахара, по- лученные в результате разрушения различных зерновых субстратов НПС. По нашему мнению, максимальной водоудерживающей способностью могут обладать арабинокси- лан и ксилан. Сама ксилоза, находящаяся вне полимерных комплексов, обладает мень- шей водоудерживающей способностью, что вызывает уменьшение вязкости химуса под действием ксиланаз. Полученный состав восстанавливающих сахаров под действием ферментов и определяет их эффективность. Чем выше количество моносахаридов, тем больше доступной энергии можно получить, и это снижает вязкость химуса. Количество высвобожденной ксилозы также указывает на эффективность ферментной композиции. 6. Результаты показались нам интересными, поскольку эффективность, т.е. количе- ство выделенных сахаров, варьировала в зависимости от мультиферментного состава, вида зернового сырья или их смеси, а также от изменения рН. 7. Полученные результаты свидетельствуют о возможности подбора эффективной мультиферментной композиции для конкретного сырья, конкретной структуры рациона еще до производственных испытаний, а также с высокой долей вероятности подтвердить матричные значения ферментов по энергии, поскольку доля дополнительно выделенные сахара есть не что иное, как дополнительная доступная энергия. 8. Сегодня лабораториям требуются простые и доступные способы сравнения ком- мерческих ферментных препаратов. Прикладная, рутинная кормовая энзимология сегод- ня нуждается в простых и дешевых методах скрининга, которые могут быть доступны не только крупным агрохолдингам, но и небольшим лабораториям на комбикормовом заводе или птицефабрике. жүктеу/скачать 5,46 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|