Жумина Асем Галымовна Тулегенова Сымбат Ержанқызы «Жасушалық биотехнология» пәні бойынша



бет15/38
Дата08.11.2022
өлшемі4,2 Mb.
#156953
1   ...   11   12   13   14   15   16   17   18   ...   38
Байланысты:
multi-213 x606468403

1. Антиденелер туралы жалпы түсінік
Антиденелер (иммуноглобулиндер, ИГ, Ig) — қан, сілекей, сүтте және басқа биологиялық сұйықтықтарда болатын гамма-глобулиндер класс тармағына жататын ақуыздар. Иммуноглобулиндерді В-лимфоциттер белгілі бір құрылымымен бөгде заттар антигендерге жауап ретінде синтездейді. Иммундық жүйе антиденелерді бөгде нысандарды (мысалы, бактериялар, вирустар) идентификациялау және бейтараптандыру үшін қолданады. Антиденелер екі маңызды функцияны орындайды: антиген-байланыстырушы қызметі және эффекторлық (например запуск классической схемы активации комплемента и связывание с клетками), арнайы гуморалды иммунитеттің маңызды факторы болып келеді.

Сурет 1 Антиденелер құрылымының жалпы сызбасы
Антиденелер салыстырмалы түрде ірі (~150 кДа — IgG) гликопротеидтер болып табылады. Олар екі ауыр (H-тізбектер, өз кезегінде олар VH, CH1, шарнира, CH2 және CH3 домендерден тұрады) және екі жеңіл тізбектен (VL және CL домендерден тұратын L-тізбек,) тұрады. Ауыр тізбектерге ковалентті байланыс арқылы олигосахаридтер қосылған. Папаин протеаза көмегімен антиденелерді екі Fab (ағыл. fragment antigen binding — антиген-байланыстырушы фрагмент) және бір Fc (англ.fragment crystallizable —кристаллизацияға қабілетті фрагмент) бөлуге болады. Класс пен орындалатын қызметтеріне тәуелді антиденелер мономерлі (IgG, IgD, IgE, сарысулық IgA) және олигомерлі формада (димер-секреторлық IgA, пентамер — IgM) болуы мүмкін. Барлығы ауыр тізбектердің бес типін (α-, γ-, δ-, ε-және μ- тізбектер) және жеңіл тізбектің екі типін (κ-цепь и λ-цепь) ажыратады. (сурет 2).

Сурет 2. Антиденелердің құрылымы бойынша түрлері

Сүтқоректілерде иммуноглобулиндердің бес класын ажыратады — бір-бірінен құрылымы және ауыр тізбектердің аминқышқылдық құрамымен ерекшелінетін IgG, IgA, IgM, IgD, IgE ажыратылады (кесте 1, сурет 2).


Кесте 1. Иммуноглобулиндер негізгі кластарының жалпы сипаттамасы





Атауы

Қызметі

Ig G



IgG сау адамның сарысуының негізгі иммуноглобулині болып келеді (барлық иммуноглобулиндердің ішінде 70-75 % құрайды), екіншілік имундық жауабында және антитоксикалық иммунитетте белсенді. Кіші көлемінің арқасында (седиментация коэффициенті 7S, молекулалық массасы 146 кДа) плацентарлық тосқауылдан тасымалдануға және соның нәтижесінде ұрық пен жаңа туған нәрестелердің иммунитетін қамтамассыз ететін иммуноглобулиндердің жалғыз фракциясы болып келеді.

Ig E



IgE - базофилдер мен шырлы жасушалармен байланысқан, бос күйінде плазмада болмайды. Аллергиялық реакциялармен байланысты.

Ig M



IgM екі μ- тізбегі болатын негізгі төрттізбекті бірлігінің пентамері болып табылады. Белгісіз антигенге алғашқы иммундық жауап кезінде пайда болады, иммуноглобулиндер фракциясының 10 % дейін құрайды. Ең ірі иммуноглобулиндер (970 кДа) болып табылады.

Ig D



IgD плазма иммуноглобулиндер фракциясының 1% кемін құрайды, көбінесе В-лимфоциттер жарғақшасында орналасады. Қызметі әлі толығымен анықталған жоқ. В-лимфоциттер үшін антигенге әлі ұсынылмаған антигенді рецептор болып табылады деп болжамдайды.

Ig A



Сарысудағы IgA барлық иммуноглобулиндердің 15-20% құрайды. Адамда IgA молекулаларының 80 % мономерлі формамен ұсынылаған. Секрециялық IgA секрециялық компонентпен кешенде димерлі формамен ұсынылған. Ол ұйыма-шырышты сұйықтықтарда (мысалы, сілекей, уызда, сүтте, респираторлы және жыныс пен зәр шығару жүйесінің шырышты қабаттарымен бөлінеді) болады.



2.Моноклонды антиденелер туралы түсінік

Эволюция барысында сүтқоретілерде ағзаны уытты заттар мен инфекциялық агенттерден қорғайтын жасушалық жүйелерінің жиынтығы қалыптасты. Қорғаныс реакциясының құрамдық бөлігі лимфалық жүйенің жасушалары арқылы арнайы нәруыздардың (антиденелердің) индукциялық өндірісі болып табылады. Соңғылар бөгде заттармен (антигендермен) қосылады және иммундық жүйенің басқа нәруыздардың көмегімен (соның ішінде комплемент жүйесі) олардың әсерін бейтараптандырады. Иммунологиялық стимулға жауап ретінде әрбір антиденені өндіретін жасуша антиген молекуласының жеке бөлігін (эпитоп, антигенді детерминантаны) танитын антиденелердің тек қана бір түрін синтездеп бөледі. Әдетте антиген молекуласында бірнеше әртүрлі эпитоп болғандықтан, олардың әрқайсысына қарсы антиденелерді иммундық жүйенің жеке жасушалары өндіреді. Жеке бір антигенмен әрекеттесетін осындай антиденелер поликлонды деп аталады.
Жиырмасыншы ғасырдың басында антиденелер поликлондылығы туралы ештеме білгілі болмаса да, олардың ерекшелігін инфекцияны басу үшін қолдану мүмкіндігі анық болды. Кейін антиденелерді клиникалық үлгілерде уытты заттарды анықтау үшін диагностикалық құрал ретінде қолданылды. Өкінішке орай поликлонды антиденелер препараттарының тиімділігі бір партиядан екінші партиядан өзгеріп тұрады, өйткені бір жағдайларда иммунизацияны өткізген кезде антиденені өндіретін жасушаларға антигеннің бір детерминанттары ықпал етеді, ал басқа жағдайларда иммундық жүйе сол антигеннің басқа эпитоптарына белсендірек жауап береді. Бұл жағдай әртүрлі препараттардың антигендерді бейтараптандыру қабілеттеріне әсер ету мүмкін, өйткені жеке эпитоптар әртүрлі тиімділікке (ықпал ету қабілетіне) ие. Сондықтан поликлонды антиденелердің осы партиясында негізгі эпитопқа бағытталған молекулалардың саны аз болуы мүмкін, соның нәтижесінде ол алдыңдағы партияның тиімділігіне қарағанда анағұрлым төмен болады.
Сонымен диагностикалық немесе терапевтік құрал ретінде антиденелердің тәжірибелік қолдануы үшін өсіріндіде өсетін және арнайы антиген-нысанаға жоғары сәйкестікке ие бір типті антиденелерді өндіретін жасушалар линиясын — моноклонды антиденелерді жасап шығару керек болды. Осындай жасушалық линия антиденелердің ұқсас молекулалардың сарқылмас көзі болар еді. Өкінішке орай, антиденелерді синтездейтін В-лимфоциттер (B-жасушалар) өсіріндіде өсірілмейді. Осы мәселенің шешімі гибридті жасушалардың жасап шығаруы болып көрінді. B-жасушаның генетикалық материалын алып, ол антиденелерді синтездеуге қабілетті болар еді, ал үйлесімді типті жасушадан бөлінуге қабілетіне ие болып, өсіріндіде өсе алар еді. Кейбір кезде В-лимфоциттер қайта туындап, қатерлі ісік (миеломалық) жасушаларына айналып, өсіріндіде өсуге қабілетке ие болады және дәл сол кезде B-жасушалардың көпшілік қасиеттерін сақтап қалатыны белгілі болған. Миеломаның ең алдымен антиденелерді өндірмейтін осындай жасушалары В-жасушалардың антидене өндіретін жасушаларымен бірігу үшін кандидаттар болады. 70-ші жылдардың ортасында осы идеялар ақиқатқа айналды.
Сонымен, моноклонды антиденелер (Monoclonal antibodies) бір эпитопқа қатысты қатал түрде арнайы бір типті антиденелер (антигенді детерминанта).

3. Гибридомаларды алу
Моноклонды антиденелерді гибридома— қалыпты антиденені өндіретін жасушалар мен шексіз өсуге қабілетті миеломалық қатерлі ісігі бар жасушалармен біріккен кезде алынған жасушалық гибридтер синтездейді.

Бір типті антиденелерді өндіретін гибридті жасушалық линияны алу үдерісіндегі бірінші қадам тышқандарға антигенді енгізу болып табылады. Бірнеше апта бойы жүргізілген бірнеше иммунизациядан кейін жануарларда иммундық жауап дамығанын тексереді.
Егер жауап дамыса, сонда жануарларды өлтіріп, көкбауырларын алады. Содан кейін оны жуып, ұсақтатқаннан кейін арасында антиденені өндіретін B-жасушалар да болатын жалғыз жасушаларды босату үшін аздап сілкиді.
Қалқып жүрген көкбауыр жасушаларын гипоксантин-гуанин— фосфорибозилтрансфераза (HGPRT~) бойынша кем миеломалық жасушалармен араластырады. Осы қоспаны бірнеше минут бойы 35%-дық полиэтиленгликольде инкубациялайды, содан кейін гипоксантин, аминоптерин мен тимидині бар ортаға (ГАТ ортасы) енгізеді.
Полиэтиленгликольмен өңдеу жасушалардың бірігуін оңайлатады, дегенмен бірігу сирек өтеді және жеткілікті дәрежеде кездейсоқ жағдай болып табылады. Қоспада миелома, көкбауыр және біріккен миелома-көкбауыр, миелома-миелома, көкбауыр-көкбауыр жасушалары бар. Бірақ ГАТ ортасында тек гибридті миелома-көкбауыр жасушалары ғана өсе алады, қалған жасушалар типтері осы ортада пролиферацияла алмайды. Көкбауыр жасушалары және көкбауыр-көкбауыр жасушалары өсіріндіде мүлде өспейді, ал HGPRT~ миеломалық жасушалары мен миелома-миелома біріккен жасушалары пуринді негіздер гуанин мен адениннің биосинтезі үшін гипоксантинді қолдана алмайды. Ал осы негіздерсіз нуклеин қышқылдарының синтезі мүмкін емес (сурет 3). Бірақ оларда пуриндер синтезінің басқа табиғи жолы (дигидрофолатредуктазаның қатысуымен) бар, сондықтан ортаның құрамына осы ферменттің белсенділігін ингибирлейтін аминоптерин кіреді. Сонымен, HGPRT~ миеломалық және біріккен миелома-миелома жасушалары ГАТ ортасында пуриндерді синтезде алмай тіршілігін жояды.



Сурет 3. ГАТ ортасының әсер ету механизмінің сызбасы


Біріккен көкбауыр-миелома жасушалары ГАТ ортасында өседі, өйткені: 1) көкбауыр жасушалары аминоптерин арқылы дигидрофолатредуктазаның қатысуымен пуриндер синтезінің бөгелуіне қарамастан ортаның экзогенді гипоксантинін утилиздей алатын функционалды HGPRT-мен қамтамасыз етеді; 2) миелома жасушалары белсенді бөлінуге қабілетті. Тимидин дигидрофолатредуктазаның ингибирленуімен байланысты пиримидиндер синтезінің бөгелуін жою үшін қажет. Жасушалардың бірігуінен кейін 10-14-ші күндеріне қарай ГАТ ортасында тек біріккен көкбауыр-миелома жасушалары ғана қалып өседі. Содан кейін оларды пластикті микротитрлеуші плашкалардың ойықтарына енгізіп, ГАТ-сыз толық өсірінді ортасында өсіреді.




Сурет 4. Гибридоманы алу сызба-нұсқасы

Арнайы антиденелерді бөліп шығаратын гибридті жасушалар линияларын идентификациялау.

Енді иммунизациялаушы антигенге антиденелерді өндіретін гибридті жасушаларды идентификациялау керек. Сол үшін әдетте бөлініп шығарылатын антиденелер болатын өсірінділік орталарының скринингі жүргізілдеі. Өсіп жатқан жасушалар бар ойықтардан ортаны алып басқа микротитрлеуші плашканың ойықтарына тасымалдайды. Соңғыларының ойықтарын антиген-нысана молекулалары қабатымен алдын ала жабылған. Егер өсірінділік ортада осы антиген эпитоптарының бірін танитын антидене (бірінші антидене) болса, сонда ол антигенмен байланысып, шайғаннан кейін ойықтарда қалады. Содан кейін ойықтарға тышқан антиденелеріне арнайы болатын екінші антидене қосады. Ол антигенмен байланысты кез келген бірінші антиденеге қосыла береді.

Сурет 5. Арнайы антиденелерді бөліп шығаратын гибридті жасушалар линияларын идентификациялау

Иммундық талдауда қолданылатын екінші антиденеге боялмаған субстратты боялған қосылысқа айналдыратын ферментті алдын ала қосады. Түсін өзгерткен ойықтар бастапқы өсірінділік ортада осы антигенге арнайы антидене болғанын көрсетеді. Егер осындай антидене ортада болмаса, екінші антидене үшін қосылатын зат болмайды, сондқтан ол екінші рет шайғанда жойылады. Осындай ойықтарда субстрат боялмайды. Ортасы оң иммундық жауап (түстің өзгеруі) беретін бастапқы микротитрлеуші плашкадағы ортада біріккен жасушалар қоспасы болуы мүмкін.


Бір жасушадан пайда болған линияларды (клондарды) алу үшін осындай ойықтардан жасушалық суспензияны өсірінді ортасымен сүйылтып, басқа ойықтарға егеді. Алынған клондарды өсіріндіде өсіргеннен кейін орталарды жасушалар линияларының (гибридом) қайсысы антиген-нысананы танитын моноклонды антиденелерді өндіретінін анықтау үшін қайтадан тестілейді Бірден көбірек арнайы гибридома алғанда әртүрлі клондар өндіретін антиденелер бір антигендік детерминантқа бағыттала ма екенін анықтауға мүмкіндік беретін зерттеулерді жалғастырады. Моноклонды антиденені өндіретін әрбір клонды өсіріндіде шексіз көп уақыт өсіруге болады. Одан басқа үлгілерді сұйық азотта қатырып тастап, кейін оларды жасушалар көзі ретінде қолдануға болады.
Моноклонды антиденелерді қолдану ELISA әдісінің ерекшелегін біраз жоғарлатуға мүмкіндік береді, өйткені олар тек белгілі бір антигенді сайтымен ғана байланысады. Қазіргі кезде әртүрлі патогенді ағзалар мен қосылыстарды анықтау үшін қолдануға болатын моноклонды антиденелердің бір қатары алынды. Гибридомалық жасушалар өсіріндісінен моноклонды антиденелерді алудың баламасы Е. coli көмегімен антиген-нысанаға қарсы бағытталған моноклонды антиденелер мен олардың бөліктерін (Fv-фрагментов) өндіру болуы мүмкін.




Достарыңызбен бөлісу:
1   ...   11   12   13   14   15   16   17   18   ...   38




©engime.org 2024
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет