Казакстан республикасының білім және ғылым министрлігі
Сабақтың жоспары және қысқа мазмұны
жүктеу/скачать 0,72 Mb.
|
stud.kz-74553
| Сабақтың жоспары және қысқа мазмұны. Сабақта келесі сұрақтар қарастырылу керек:
Гибридомды технологиямен танысу. Әдістің ұстанымы. Моноклондарды алу. Тышқандардан жасанды ісік – гибридомалар – алу. Гибридомалардан және иммундық жасұшалардан гибридтық жасұшаларды алу. Моноклоналды антиденелерді алғанда ұйымдастырылатын жұмыстар және қолданылатын құрал-жабдықтар. Сынауға жануарларды таңдау. Биологиялық құрылымдарды зерттегенде, осы құрылыммен өзгеше қарым-қатынасқа кіретін реагенттерді іздеу – зерттеулердің негізі. Осындай қасиет әмбебабты реагентте – иммуноглобулиннің молекуласында бар. Иммуноглобулиндер антидене болып тек қана антигендермен қарым-қатынасқа кіреді. Бірақ көп құрылымдарға жағдай тұдырса, олар антигенге айналып комплементарлы антиденелер жаратылуға жағдай тұдырады (мысалы, күшті иммуногендермен коньюгатталғанда). Сондықтан биологияның және медицинаның әр түрлі бөлімдерінде негізінде антиденелермен қолдану жатқан иммунологиялық әдістер кең таралған. Әдістің тарихы. Зерттеушілердің мақсаты – өзгешелігі жоғары антиденелерді алу әдістерін табу. Бір белгілі жағдайда бактериалды полисахаридтермен иммунизация өткізсе – өзгешелігі жоғары антиденелердің жоғарыгомогенді аппаратын алуға болады. Осыдан басқа, плазмацитоманың (антидене жарату жасушадан жаратылған ісік) иммунды жануардың көк бауырының жасұшаларымен қосылуы мүмкін. Осылай гибридтік жасұшалар (гибридомалар) алынады. Гибридомалар ісік жасұшалардан шексіз көбею мүмкіншілігін, ал көк бауырдың жасұшаларынан – белгілі өзгешелігі бар антиденелер синтездеу мүмкіншілігін алған. Моноклоналды антиденелерді синтездейтін гибридомаларды алу әдісіне келесі методологиялық жұмыстар жол берген: Миеломалар алу, оларды ағзадан бөлек өсіру; Жасұшалардың соматикалық гибридизация әдісі. Вирустерге қарсы тұратын иммуноглобулиндер поликлоналды гетерогенді антиденелер болады. Неге десек – олар әр түрлі клондардың В-лимфоциттерінің қоспасы. Антигеннің молекуласының белсенді топтарының (бір неше аминқышқылдар) кешеңіне қарсы иммунды жасұшаларда (гибридомаларда) бір белгілі иммуноглобулин (моноспецификалы антидене) синтезделеді. Иммундық жасұшалардың ісік жасұшалармен гибридизациясы жасанды ісік – гибридома жаратады. Оны алу техникасы гибридомды технологияға жатады. Гибридомаларды жасұшалардың бір клонымен (моноклоналды антиденелер (МКА)) секреттелетін гомогенді антиденелер шығарады. Әдістің ұстанымы. Гибридомаларды алу әдістің негізінде көкбауырдың сенсибилизденген лимфоциттердің және миеломды жасұшалардың қосылуынан кейін гибридтік жасұшалардың сериялық өсіруі жатыр. Кейіннен керекті ерекшелігі бар антиденелерді секреттейтін клондарды іріктейді. Іріктелген клонды жасұшалардың дақылдары ретінде сақтайды немесе тышқандардың ағзасында асцидтік ісік ретінде сақтайды. Гибридомды технология бір неше кезеңдерден тұрады: дайындық жұмыстар, моноклондарды алу, клондарды сақтау, реклондау, асцидтік ісік алу, антиденелерді тесттілеу, антиденелерді тазалау. Иммунизацияға алдын ала тазаланған антигенмен қолданады. Тышқандардың қарынына минерал майын немесе инертті қатты пластикті еңгізіп жануарлардың ағзасында ісік жаратылуға жол береді. Миелома жаратылуға жануардың генетикалық қасиеттері өте маңызды болады. Инбредтік тышқандардың тек қана екі түрінен осы ісіктерді алуға мүмкіншілік тұды. Антигенді 3-5 рет 0,5-5 мг мөлшерде еңгізеді. Бірінші инъекцияны Фрейнд адьювантымен жануарға 0,5 мл мөлшерде салады. Ақырғы иммунизациядан 2-4 күн өткеннен кейін тышқандарды өлтіріп, көкбауырдың жасұшаларының суспензиясын дайындайды: көкбауырды зарарсыздандырылған жағдайда шығарып алып, оны хирургиялық пинцеттің көмегімен немесе сүзгіштен өткізіп бұзып суспензия жасайды. Суспензия көлемін 10 мл дейін Эрл ортасымен немесе тұзды буфермен жеткізеді. Суспензияны 170 об/мин 15 минут центрифугадан өткізеді. Микроскоп астында алынған суспензияның жасұшаларының өмірге кабілеттігін анықтайды. Анықтау жұмысын өткізгенде үлгілерді көк трипанның 0,1 пайыздық ерітіндісімен бояйды. Көкбауырдың жасұшаларының суспензиясын гибридизациялық қосылуға дайындайды. Ол үшін алдын ала қосылудың алдында бір тәүлік бұрын 24-ұялық полистиролды платаның ұяларына 400 мкл қоректік жасұшаларды салады. Қоректік жасұшалар ретінде тышқандардың немесе теңіз шошқалардың макрофагтарын алады. Қосылуды келесі түрде өткізеді: центрифугалық сынауықта 1 мл-де 75 пайызы өмірге жарамды қасиеті бар 108 көк бауырдың жасұшаларын және 107 миеломды жасұшаларды араластырады: 5 мл Дульбекко модификациялаған Игла ортасымен (МДСИ) жуады және 5 минут 100 об/мин центифугадан өткізеді; тұнбаны 50 мл ыдысқа құяды. Кейіннен тұнбаға абайлап тамшымен 0,5 мл 50 пайызды ПЭГ 4000 ерітіндісін қосады, ыдысты 1 сағат аралығында сілкіп қойып суспензиялайды. Кейіннен қоспаға (суспензияға) тамшымен 10 мл МДСИ қосады; 10 минуттан кейін көлемді ГАТ ортасымен (құрамында гипоксантин, амидоптерин, тимин кешені) 50 мл-ге дейін жеткізеді. Алынған суспензияны 1 мл-ден 24 ұялы платаға құйып 37 градуста 5 пайызды көмірқышқыл газы бар көмірқышқылды инкубаторда ұстайды; әр бір 4 күнде ортаны ауыстырып отырады. 2 – 4 жұма өткеннен кейін тірі қалған клондарды қоректік жасұшалары бар 96-ұялы платаға отыртады. Клондардың өмірге жарамдығын микроскоп астында анықтайды. Дақылды суйықтықты жұма сайын радиоиммундық, иммунофлуоресценттік және иммуноферменттік әдістер арқылы тексеріп тышқан иммуноглобулиндерінің барын анықтайды. жүктеу/скачать 0,72 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|