Лекция: 15 с Лабораториялық сабақтар 15с СӨЖ: 30с обсөЖ : 30с
жүктеу/скачать 4,19 Mb.
|
ДНҚ-ның нуклеотидтік тізбегін анықтау Қосспиралді ДНК өлшемдері бір макромолекулаға келетін нуклеотид жұбы (н.ж.) арқылы сипатталады. Клеткалық немесе вирустық ДНК үшін олар үлкен шамада айырмашылығы болады Мысалы,аса көп зерттелген бактериалық плазмидалар көптеген вирус және бактериофаг ДНК-лары бірнеше мың нуклеотид жұбынан (н.ж.) тұрады.Бактериялардың жыныс факторлары, митохондрилар және хлоропласт ДНК-сы бірнеше жүз нуклеотид жұбынан (н.ж.) тұрады . Бактериялардың хромосомдары —бірнеше миллион нуклеотид жұбы (н.ж.), ашытқылапр хромосомдары шамамен 107 нуклеотид жұбын (н.ж.) құрайды.Адам жиынтық хромосомаларының ДНК ұзындығы 3-109 нуклеотид жұбын (н.ж.) құрайды ДНК-ның нуклеотид кезектілігін анықтайтын заманауи әдістер бір ғана экспериментте 150—300 нуклеотид қалдықтарынан тұратын фрагменттерді секвенирлеуге {ағылш. sequence — кезектілік) мүмкіндік береді.Сондықтан Поэтому ДНК-ның бастапқы молекуласы алдын ала фрагменттеледі.Олүшін көбінесе ДНК-ны рестриктазалармен гидролиздейді. 
Бұл фрагменттердің нуклеотид кезектілігін анықтаған соң бүкіл ДНК-ның бірінші реттік құрылымын анықтауға мүмкіндік береді. ДНҚ-ның нуклеотидтік тізбегін анықтаудың екі принципті айырмашылығы бар әдістері бар.Оның біріншісін А. Максам мен У. Гилберт ұсынған .Ол полинуклеотид тізбекті арнайы химиялық ыдыратуға негізделген. ДНК -ны Максама —Гилберт әдісі бойынша секвенирлегендегі операциялардың реті жалпы түрде мына суретте көрсетілген. 
Бұл әдістің негізгі принциптері мынадай: 1. Радиоактивті таңба енгізілген ДНК фрагментінің ұшы гомогенді болуы керек. 2.Анализделетін ДНК тізбегінің үлгісі 4 бірдей порцияға бөлінеді,және химиялық модификация жағдайлары осы 4 порцияның әрқайсысында реакцияға бір немесе екі пурин немесе пиримидин негіздерінің біреуі ғана қатысатындай етіп таңдалады.; пуриндік негіздерді N7-aтом бойынша диметилсульфатпен метилдейді, пиримидинді негіздерді гидразинмен өңдеу арқылы ыдыратады; химиялық реагенттермен өңдеу екі жағдайда да модифицирленген мономерлі звеноның түзілуіне әкеледі,оны полинуклеотид тізбектен бөліп алуға болады. 3. Химиялық модификация шектелген жағдайларда жүргізіледі.. 4. Негіздерді бір нуклеотид қалдығна дейін дәлдікпен анықтауға болады. 5 Фрагменттердің ұзындықтарын жоғары сезімтал полиакриламид гелінің жұқа қабатындағы электрофорез әдісі арқылы анықтайды. Электрофорез жоғары температурада 7 М мочевина бар буферлік жүйеде жүргізілгендіктен фрагментердің екінші реттік құрылымы бұзылады Екінші әдісті Ф. Сэнгер әріптестерімен жасаған .Оның негізінде ДНК-полимеразалық реакция жатыр.Әдістің принципі суретте көрсетілген 
Қазіргі уақытта Максам – Гилберт және Сэнгер әдісі сияқты әр түрлі әдістер бар және оларды толық автоматтандыруға сәті түсті . Дәл осылай , мысалы , ДНК секвенирлеу үшін праймердің 5'- ұшына соңына флоуресценциялық таңбаларды енгізеді , және де әрбір талданатын нуклеотидтардың төртеуінің әртүрлі спектрлік мінездемелерін анықтауда флоуресценциялаушы агенттерді қолданылады . Барлық биохимиялық операциялар роботпен өткізіледі . ДНК толық нуклеотидті жүйелілігін анықтауда автоматтардың қолдануы принципті түрде кез келген организм геномын адамның геномын да анықтауға мүмкіндік береді .
жүктеу/скачать 4,19 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|