P aeruginosa штаммдарының метаболиттерінің E. coli lux+ биолюминесценциясына әсері зерттеліп, олардың потенциалды патогенділігін бағалау үшін биолюминесценттік әдісті қолданудың мақсаттылығы тәжірибе жүзінде дәлелденді
жүктеу/скачать 26,75 Kb.
|
Документ (45)
|
P. aeruginosa штаммдарының метаболиттерінің E. coli lux+ биолюминесценциясына әсері зерттеліп, олардың потенциалды патогенділігін бағалау үшін биолюминесценттік әдісті қолданудың мақсаттылығы тәжірибе жүзінде дәлелденді. Жұмыста P. aeruginosa (n = 27) клиникалық изоляттарының экзометаболиттері қолданылды. Потенциалды патогендік индексі (PPI) PPI = (Ik – Io)/Ik 100% формуласы арқылы есептелді, мұндағы Ik – ішек таяқшасы люкс+ бақылау үлгісінің (LB) биолюминесценциясының қарқындылығы, Io – биолюминесценцияның қарқындылығы. сынақ үлгісі (экзометаболиттер). Талдау шарттары мен әсер ету ұзақтығы анықталды. Потенциалды патогендік индексі бойынша P.aeruginosa штамдары патогенділігі төмен штаммдар, орташа және жоғары патогенді штаммдар болып үш топқа бөлінеді. IPP кемінде 70% болатын топ пиоцианинді өндіру деңгейімен және пленка түзу қабілетімен айтарлықтай жоғары корреляция коэффициентімен сипатталды. Бұл P.aeruginosa изоляттарының, атап айтқанда, іріңді-септикалық инфекцияларда (ПСИ) агрессивтілік дәрежесін бағалау үшін скрининг немесе қосымша әдіс ретінде биолюминесценттік әдісті қолдану мүмкіндігін көрсетеді. Pseudomonas aeruginosa – ауруханаішілік инфекциялардың белгілі қоздырғышы, ауруханаішілік пневмонияның және басқа да іріңді-септикалық инфекциялардың (ПСИ) этиологиясы бойынша бірінші орында, өлім деңгейі жоғары [7-9]. Пациенттердің иммун тапшылығы жағдайын, антибиотиктер мен дезинфекциялау құралдарының селективті әсерінің фонында инвазиялық процедуралардың көптігін ескере отырып, ауруханалардың жағдайлары оларда айналатын Pseudomonas aeruginosa штамдарының агрессивтілігін қоздырып, күшейтетіні анық. P.aeruginosa-ның патогенділігі тіндерге ену және сақталуы мүмкіншілігімен, сонымен қатар цитотоксикалық заттардың жиынтығымен, мысалы, экзотоксин А, пиоцианин, фосфолипаза С, шығаруды қамтамасыз ететін III типті экскреция жүйесінің өнімдерімен анықталады. Бактерия жасушасының ішкі ортасынан экзоферменттердің және олардың эукариот ішінде транслокациялануы жасушаларды тікелей нысанаға (ExoS, ExoT, ExoY, ExoU) жібереді [8]. P. aeruginosa-ны белсенді түрде зерттеу токсигенді факторларды синтездеу және бөлу қабілеті бойынша оның популяциясының гетерогенділігін көрсетті [11, 14, 16]. Қазіргі уақытта медициналық мекемелерде оқшауланған P.aeruginosa штаммдарының көп мөлшерін жылдам, үнемді бағалау және саралау қажеттілігі туындайды. Алайда, осы бактериялардың жеке қасиеттерін бағалаудың дәстүрлі микробиологиялық әдістері P. aeruginosa-ның патогендік әлеуеті туралы тұтас көзқарасты қалыптастыруға мүмкіндік бермейді, бұл басқалармен қатар, биологияда белгілі улы заттардың өзара әсер етуіне байланысты. бірге әрекет ету. Қазіргі уақытта биомедициналық зерттеулерде және клиникалық медицинада биолюминесценттік реакцияға негізделген әдістер кеңінен қолданылады [17]. Олардың жоғары сезімталдығы және әртүрлі агенттерге жылдам реакциясы оларды биологиялық белсенділіктің ингибиторларының үлкен санын бағалаудың тиімді құралына айналдырады. Люминесценция гендері бар E. coli рекомбинантты штаммдары медицинадағы биолюминесценцияның ауқымын айтарлықтай кеңейтеді және скринингтік талдау мәселелерін шешуге көмектеседі [2, 3, 5]. Дегенмен, P.aeruginosa токсигенділігінің көрсеткіші ретінде биолюминесценцияны қолдану туралы деректер жоқ. Бұл жұмыстың мақсаты – P.aeruginosa референтті және клиникалық штаммдарының метаболиттерінің E. coli lux+ биолюминесценциясына әсерін зерттеу және олардың потенциалды патогенділігін бағалау үшін биолюминесценттік әдісті қолданудың мақсаттылығын эксперименттік негіздеу. Материал және әдістер Пермь қаласындағы ірі хирургиялық ауруханаларда қабыну белгілері бар науқастардың әртүрлі биологиялық материалдарынан P. aeruginosa клиникалық изоляттары (n = 27) бөлініп алынды. Салыстыру үшін P. aeruginosa штаммы ATCC 27853 пайдаланылды. Рекомбинантты биолюминесцентті E. coli lux+ (толық люкс regulon Vibrio fischeri) [2] салқындатылған H2O (бір ампулаға 1 мл) 30 минут бойы 4°C температурада регидратацияланды. Содан кейін сенсор суспензиясы жұмыс көлеміне дейін 0,9% NaCl сұйылтылған және 20 ° C температурада 30 минут бойы ұсталған. Бастапқы жасуша саны 6108 CFU/ml (McFarland стандарты бойынша 2,0-ге дейін) P. aeruginosa клиникалық және анықтамалық штаммдары Лурия-Бертани сорпасында (LB, pH 7,0) 1 : 4 қатынасында егілді. және 37°C температурада 18 сағат бойы статикалық өсіріледі. Экзометаболиттер Eppendorf микроцентрифугасында (Германия) 10 минут ішінде 13000 айн/мин жылдамдықта P. aeruginosa түнгі культурасынан 1–2 мл центрифугалау және сүзу (кеуек диаметрі 0,22 мкм) арқылы алынды. Судың үстіңгі қабаты талдауда бірден немесе –18°C температурада 1 сағат мұздатылғаннан кейін қолданылды. 50 мкл толық экзометаболиттер датчиктің 50 мкліне алдын ала ақ 96 шұңқырлы полистирол пластинасының шұңқырларына құйылды. Қоспа 20°С температурада 60 минут ұсталады. Өлшемдер 15, 30, 45 және 60 минуттан кейін Luminoscan Ascent пластиналы люминометрін (Финляндия) пайдалана отырып жүргізілді. E. coli lux+ люминесценциясының басылуы P. aeruginosa потенциалды патогенділігін бағалау құралы ретінде қарастырылатындықтан, тежегіш әсерді талдау үшін потенциалды патогендік индексі (ППИ) ұсынылды, ол PPI = ( формуласы бойынша есептеледі. Ik – Io)/Ik 100%, мұндағы Ik — бақылау үлгісінің люминесценция қарқындылығы (E. coli lux+ + LB); Io – зерттелетін үлгінің (E. coli lux+ + метаболиттері) биолюминесценция қарқындылығы. Биопленка түзілуін И.А. Шахинян және т.б. [он]. Гемолитикалық белсенділік 24 сағат инкубациядан кейін 5% қанды агарда зерттелетін штаммдардың колонияларының айналасындағы клирингтік аймақтың миллиметрлік өлшемімен анықталды. Пиоцианин өндірісі E. Deziel және басқалары бойынша бағаланды. Benchmark Plus пластиналық спектрофотометрде (Bio-Rad, АҚШ) 695 нм толқын ұзындығында күнделікті культураның супернатанттарының оптикалық тығыздығын (OD) өлшеу арқылы [12]. Бактериялардың антагонистік қасиеттерін зерттеу үшін П.Муриана және Т.Кленхаммер [14] бойынша модификациясы бар кешіктірілген антагонизм әдісі [6] қолданылды. Штамның антагонистік белсенділігі оны антагонистік экзометаболиттермен 5 сағат бойы өсіру кезінде сыналатын дақылдың (E. coli lux+) ұлғаюының пайызы ретінде көрсетілді. Статистикалық талдау Excel 2003 бағдарламасының көмегімен орындалды.Нәтижелері орташа арифметикалық М және орташа m стандартты қатесі ретінде берілген. Корреляция коэффициентінің статистикалық маңыздылығы p<0,05 мәнділік деңгейінде есептелді. Нәтижелер мен пікірталас Зерттеулер нәтижесінде P.aeruginosa жасушасыз экзометаболиттерін бір рет мұздату олардың E. coli lux+ люминесценциясына әсерінің айтарлықтай төмендеуіне әкелмегені анықталды. Сонымен қатар, кейбір жағдайларда мұздату экзометаболиттердің тежеу қасиеттерін аздап күшейтті, бұл А экзотоксинінің басым әсерінен болуы мүмкін, оның белсенділігі қайталанатын мұздату және еріту кезінде жоғарылайды [11]. Әрі қарайғы эксперименттерде әдістемені бір жүйеге келтіру үшін экзометаболиттер міндетті түрде мұздату-еріту қадамынан өтті, бұл әдісті клиникалық және анықтамалық зертханаларда қолдану кезінде ұсынылуы мүмкін, мұнда ex tempore талдау әрқашан мүмкін емес. P. aeruginosa штамдарының көпшілігінің экзометаболиттері E. coli lux+ люминесценциясын 66,0–96,8% шегінде тежегенімен, 15 минут байланыста болғаннан кейін кейіннен күшейтусіз (кесте), бірқатар супернатанттар биолюминесценция деңгейінің 30 шегінде максималды төмендеуіне әкелді. экспозицияның ұзаруы кезінде елеулі өзгерістерсіз мин. Бұл уақыт барлық кейінгі тәжірибелерде қолданылды. P. aeruginosa клиникалық штаммдарының экзометаболиттері E. coli lux+ сенсорының биолюминесценциясына әртүрлі әсер ететіні анықталды. P.aeruginosa-ның бірқатар клиникалық және анықтамалық штаммдарын олардың экзометаболиттерінің E. coli lux+ люминесценциясына әсер ету деңгейі бойынша салыстырмалы талдау негізінде оқшауланған дақылдар IPP бойынша топтарға бөлінді (сурет): IPP тобы < 30% — төмен дәрежелі штаммдар, II топ 30% ≤ PPI ≤ 70% - орташа дәрежелі, III топ PPI > 70% - люминесценцияның тежелу дәрежесі жоғары. Практикада дәстүрлі түрде қарастырылатын патогенділік факторларының көрінісі бойынша топқа жататынын ескере отырып, P. aeruginosa клиникалық штаммдарын салыстыру, PPI II топтағы пиоцианинді өндіру деңгейімен (r = 0,40) қалыпты корреляцияны және айтарлықтай көп екенін көрсетті. дәрежесі - III топта (r = 0,61; p < 0,05) және бұл көрсеткіштер арасындағы ең күшті оң байланыс изоляттардың барлық жиынтығы үшін (r = 0,81; p < 0,05) байқалды. Сонымен қатар, III топ штаммдарының PPI және гемолитикалық белсенділік деңгейі (r = 0,48) арасында қалыпты оң корреляция көрсетілді. Бұл факторлардың (пиоцианин, фосфолипаза С, рамнолипид) қабыну процесінің дамуына қатысуы даусыз, өйткені олар цитотоксикалық әсер және жалпыланған қабыну реакциясын ынталандыру арқылы жергілікті және жүйелі қабынудың пайда болуына тікелей әсер етеді [8, 18] . Pseudomonas aeruginosa вируленттілігі факторларының экспрессиясын анықтайтын негізгі механизмдердің бірі кооперативтік сезімталдық (Quorum sensing) құбылысы екені белгілі. Бұл жүйе барлық экзотоксиндердің (Лас жүйесі), пиоцианиннің (Rhl жүйесі) синтезін, сонымен қатар биоқабықша түзілуін бақылайды [18]. Зерттеу III топ штаммдарында қабық түзу қабілетімен күшті оң корреляцияны тіркеді (r = 0,87; p = 0,05). PPI > 70% штаммдарда жоғары белсенділік факторларының комбинациясын анықтау басқа вирулентті қасиеттердің айқын көріністерімен біріктіріледі деп болжауға болады. Аурухана штаммдары туралы заманауи идеяларға сәйкес, олар көп дәрілік төзімділікті көрсетіп қана қоймай, сонымен қатар патогендік факторлардың кең спектріне ие болуы керек, сонымен қатар басқа микроорганизмдерге қарсы антагонистік белсенділікті көрсетуі керек [1, 4]. Антагонистік белсенділікті бағалау кезінде E. coli lux+ биомассасының өсу деңгейі барлық штаммдардың метаболиттерінің әсерін ескере отырып, биолюминесценцияның тежелу дәрежесімен күшті теріс корреляцияға ие екендігі анықталды (r = –0,81; p < 0,05). ), бірақ III топтағы белгілерде (r = –0,87; p < 0,05). Жоғары вируленттілігі және антагонистік белсенділігі басқа микроорганизмдермен салыстырғанда штаммның бәсекеге қабілеттілігін қамтамасыз етеді және нәтижесінде оның шоғырлануына және стационарда таралуына ықпал етеді. Осылайша, экзометаболиттер әсерінен люминесценттік сынақ штаммының люминесценциясының өзгеруіне негізделген P.aeruginosa потенциалды патогенділігін бағалау мүмкіндігі көрсетілді. Бұл тәсіл кем дегенде екі ойға негізделген. Біріншіден, P.aeruginosa-ның негізгі патогендік факторы, экзотоксин А, прокариоттар мен эукариоттарда ақуыз биосинтезінің және басқа да метаболикалық процестердің бұзылуына әкелетін аденозинтрифосфатты рибозилдену реакциясын және II элонгация факторының инактивациясын катализдейді [11]. Люминесценция рекомбинантты E. coli lux+ штаммының негізгі қалпына келтіретін эквиваленттерінің (NAD(P), аденозинтрифосфаты), ұзын тізбекті алифаттық альдегидтердің, молекулалық оттегі — люцифераза субстраттарын ескере отырып, жасушаішілік құрамындағы өзгерістердің сипатын көрсетеді. реципиенттің рецепторлық кешені — E. coli. Екіншіден, пиоцианин пигменті және басқа факторлар, сонымен қатар жасушаішілік циклдік аденозин монофосфатының төмендеуімен супероксид радикалы және сутегі асқын тотығы сияқты аралық реактивті оттегі түрлері арқылы жасушалардың екі түріне де уытты әсер етуге қабілетті. Әдебиеттер Microtox сынақ жүйесінің (ISO № 11348) EC50 мәндері (биолюминесценцияның бақылаудың 50% тежелуі) және LD50 (өлтіретін орташа доза), эукариоттық EC50 [13] арасындағы корреляцияның жоғары деңгейін көрсетеді. P.aeruginosa сияқты шартты патогенді бактериялармен байланысты инфекциялардың зертханалық диагностикасында оларды зерттелетін патологиялық материалда анықтау оқшауланған микроб этиопатоген болып табыла ма, әлде талданған үлгінің кездейсоқ ластануы ма деген сұраққа жауап беруді талап етеді. Зерттелетін үлгінің ластану дәрежесі бойынша бағалау әрқашан адекватты емес. P. aeruginosa патогендік факторлардың үлкен жиынтығы бар екенін ескере отырып, оларды толық есепке алу және мәдени зерттеу кезінде осы микроорганизмнің патологиялық процеске ықтимал үлесін интегралды бағалау айтарлықтай материалдық және уақыт шығындарын талап етеді. Ұсынылған әдіс жылдам, біртұтас және оның GSI этиологиясындағы рөлін анықтау, инфекциялық процестің ықтимал дамуын болжау үшін оқшауланған штаммның патогендік потенциалын кешенді бағалауға мүмкіндік береді. Штамдардың госпитальдық сипатының қосымша критерийі ретінде потенциалды патогенділік индексін пайдалану мақсатқа сай. жүктеу/скачать 26,75 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|