всеми силами стремится реализовать свою зловещую программу
феноптоз
а
.
Однако уже синтезирован препарат, позволяющий в 1000 раз повысить
антиоксидантный запас митохондрий - это катионный антиоксидант, который накапливается по
электрическому полю внутри митохондрии. Такую дозу противоядия органелла вряд ли сможет
преодолеть. Первые этапы проверки гипотезы уже осуществлены и дали положительные
результаты.
3.Маркеры и методы определения апоптоза.
Флуоресцентный метод анализа выживаемости клеток с двойным окрашиванием.
Существует ряд более дорогостоящих, но эффективных подходов, позволяющих
дискриминировать живые и мёртвые клетки. Они основаны на одновременном окрашивании
клеток
несколькими флуорофорами. В одном из таких методов используются бромид этидия и
кальцеин АМ. Отрицательно заряженный бромид этидия, подобно PI, проникает только в клетки с
повреждённой мембраной, интеркалирует в ДНК и флуоресцирует в красной области. Кальцеин
АМ (ацетооксиметиловый эфир кальцеина), напротив, свободно проникает через плазматическую
мембрану и в результате гидролиза клеточными эстеразами превращается в полианион кальцеин,
который обладает флуоресценцией в зелёной области и удерживается в клетках с целостной
мембраной (живых клетках) благодаря своему заряду. Анализ окрашенных
клеток
можно
проводить как методом проточной цитометрии (рис. 3), так и методом флуоресцентной
микроскопии (рис 4).
Рис. 3. Анализ выживаемости клеток HL-60 методом проточной цитометрии по
флуоресценции бромида этидия и кальцеина. Клетки инкубировали в отсутствие (А) и в присутствии хлорноватистой
кислоты, 500 µM, (Б) в течение суток. Двумерное распределение
клеток
по флуоресценции в 1-ом канале (по
горизонтали, нм, кальцеин) и в 4-ом канале (по вертикали, нм, бромид этидия) позволяет оценить количество живых и
некротических
клеток
.
Рис. 4. Флуоресцентная микрофотография клеток линии HeLa, окрашенных бромидом этидия
и кальцеином AM. Клетки инкубировали в отсутствие (слева) и в присутствии перекиси водорода, 500 µM, (справа) в
течение 2-х часов. Живые клетки окрашены зелёным (кальцеин), ядра мёртвых
Достарыңызбен бөлісу: |
