Негіздерімен "Ветеринариялық медицина", "Ветеринариялық санитария" мамандықтары бойынша ауыл шаруашылық жоғары оқу орындарына арналған оқу құралы Алматы, 2013 3



Pdf көрінісі
бет21/128
Дата08.04.2024
өлшемі3,12 Mb.
#200617
1   ...   17   18   19   20   21   22   23   24   ...   128
Байланысты:
IНДЕТТАНУ ЖӘНЕ ИНФЕКЦИЯЛЫҚ АУРУЛАР ВЕТЕРИНАРИЯЛЫҚ-САНИТАРИЯ НЕГІЗДЕРІМЕН

ДНҚ-зонд. 
Осындай тәсілдердің бірі болып генетикалық зондтар 
көмегімен іске асырылатын молекулалық гибридизация әдісі саналады. 
Аталмыш әдісте микроорганизмдердің тек бір түріне ғана телімді 
дезоксирибонуклеин қышқылының (ДНҚ) немесе рибонуклеин қышқылының 
(РНҚ) нуклеотидтік тізбегінің кішкене учаскесі қолданылады. ДНҚ-зондты 
белгілі бір микроб жасушасына тән белгілеріне ғана жауапты нуклеотидті 
химиялық жолмен синтездеу арқылы алып, оларды изотоп, флюорохром 
немесе ферментпен таңбалайды. Құрамында ДНҚ бар зерттеуге алынған 
микроорганизм үлгілеріне таңбаланған зондты қосқан жағдайда нуклеотидтік 
тізбегі комплементарлы байланысқа түседі. Таңбалауға алынған заттардың 
түріне қарай пайда болған кешенді радиоизотоптық талдаумен, иммунды-
ферменттік талдаумен немесе иммунофлуоресценция реакциясымен анық-
тайды. Молекулалық гибридизация әдісі микроорганизмдердің нуклеин 
қышқылдарының концентрациясы жоғары болған жағдайда ғана анықтауға 
мүмкіншілік береді. 
Полимеразалық тізбектеу реакциясы (ПТР). 
Реакцияны 1983 жылы 
Кэри Мюллис ашқан. ПТР кейінгі кезде инфекциялық аурулардың балауында 
қолданылатын нақты және сезімтал әдістердің бірі болып саналады. 


32 
Полимеразалық тізбектеу реакциясы бактерия немесе вирустардың генін in 
vitro жағдайында термостабильді ДНҚ-полимераза ферментінің көмегімен 
бірнеше миллион есе көбейтіп алып (амплификация), электрофорезбен 
анықтауға бағытталған. Бұл реакция ДНҚ репликациясы деп те аталады. 
Табиғи жағдайда ДНҚ репликациясы бірнеше сатыдан тұрады: 1) ДНҚ 
денатурациясы (ДНҚ қос жіпшесінің тарқалып, ажырауы); 2) ДНҚ-ның 
синтезделуіне қажетті қысқа екі тізбекті ДНҚ учаскесінің қалыптасуы; 3) 
ДНҚ-ның жаңа тізбегінің синтезделуі (қос жіпшенің комплементарлы 
құрастырылуы).
Бұл реакцияда микроорганизмдер генінің учаскесінің құрылымын 
қайталауға қатынасатын, жасанды жолмен синтезделген олигонуклеотид пен 
Tag-полимераза ферменті қолданылады. Tag-полимераза ферментінің 
көмегімен ДНҚ-ның телімді фрагменті қалыптасады. Жаңадан қалыптасқан 
ДНҚ фрагменттері нуклеин қышқылдарының жаңа тізбектерін синтездеуге 
арналған матрица ретінде амплификацияның келесі циклдерінде пайдала-
нылады. 
Полимеразалық тізбектеу реакциясының қойылымы үш кезеңнен 
тұрады: биологиялық материалдардан ДНҚ бөліп алу; полимеразалық 
тізбекті реакцияны қою; электрофорез немесе гибридизациялы-ферменттік 
детекция (амплификация өнімдерінің детекциясы).
Жұмыстың әрбір кезеңі міндетті түрде жеке бөлмелерде, санитарлық-
гигиеналық талаптар мен санитарлық-эпидемиологиялық ережелерді сақтай 
отыра, ПТР-ға арналған жиынтық көмегімен жүргізілуі тиіс. ПТР-ға арналған 
жиынтық құрамы үш комплекттен тұрады: №1 комплект – биологиялық 
материалдардан ДНҚ бөліп алуға, №2 комплект – ДНҚ амплификациясына, 
ал №3 комплект – ДНҚ детекциялауға арналған. 
ДНҚ бөліп алуға қажетті комплект құрамына лизиске ұшыратушы 
ерітінділер мен сорбент кіреді. Үлгілерді өңдеу жұмыстары көлемі 1,5 мл 
болатын микроцентрифуга түтіктерінде 90-120 минут бойы жүргізіледі. 
Центрифугаланған үлгі тұнбасын лизиске ұшыратушы ерітіндімен өңдеп, 
депротеинизацияланғаннан кейін сорбент көмегімен тазартады. 
Полимеразалық тізбектеу реакциясын қою үшін қолданылатын комплект 
құрамына ПТР-буфер, дезоксинуклеозидүшфосфаттар қоспасы, телімді қос 
олигонуклеотидті праймерлер, Tag-полимераза, минералды май кіреді. 
Зерттеуге алынған үлгінің белгілі бір мөлшерін арнайы «Eppendorf» 
түтікшелеріне енгізгеннен кейін үстінен амплификациялаушы қоспаларды, 
Tag-полимераза ферментін және бір тамшы минералды майды қосады да 
автоматтандырылған термостатта амплификация процесі 2-3 сағат аралы-
ғында жүргізіледі. Зерттеуге алынған үлгілермен бірге бақылау үлгілері де 
қатар қойылады. 
Нәтижелерді тіркеуге арналған комплект құрамына электрофорез 
буферлерінің қоспалары мен агароза гелі жатады. Жұмыстың бұл кезеңі 
амплификацияланған телімді ДНҚ фрагменттерін құрамында этидий бромиді 


33 
бар 1%-ды агароза геліндегі электрофорез көмегімен іске асырылады. 
Электрофореграмма нәтижесі ультракүлгін сәуле шығаратын трансиллюми-
наторда оң нәтиже көрсеткен амплификация өнімдері (ДНҚ) мен бақылауға 
алынған ДНҚ препаратында қызғылт-сары түсті болып жарқырап көрінеді.
Төменде сиыр бруцеллезінің балауына Қазақстанда өндірілетін диагнос-
тикалық препараттарды қолданып, практикалық жағдайда қолдануға ыңғай-
ландырылып, ұсынылған (Сайдулдин Т.С., Қасымов Е.И., 1990) ИФТ-ның 
жанама вариантын қою, нәтижесін есепке алу әдістемесі көрсетіледі (ҚР 
АШМ ғылыми-техникалық кеңесінде қаралып, қолданылуы бекітілген).


Достарыңызбен бөлісу:
1   ...   17   18   19   20   21   22   23   24   ...   128




©engime.org 2024
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет