Жаратылыстану факультеті
жүктеу/скачать 2,07 Mb.
|
МГҚА. 15 лекция.
| 15- лекция. Гендік инженерия. Хромосомалық және геномдық инженерия.
Гендік инженерия (ген инженериясы) деп in vitro жағдайында функциялық пәрменді генетикалық құрылымдарды (рекомбинантты ДНҚ-ны) құрастыруды және оларды тірі клетқаларға енгізуді айтады. Рекомбинантты ДНҚ (рДНҚ) деп әр текті ДНҚ-лардан құралған (табиғи немесе синтетикалық ДНҚ фрагменттерін жалғастыру арқылы) және жасушаларда репликациялана алатын генетикалық құрылымды айтады. Гендік инженерия мынадай кезеңдерден тұрады: 1) генді (ДНҚ фрагментін) алу; 2) рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастыру; 3) реципиент жасушасына рекомбинантты ДНҚ молекуласын енгізу; 4) қажет рекомбинантты ДНҚ молекулалары бар клондарды (бактериялық жасушаларды) ортадан табу. Генді алу. Генді алудың үш әдісі бар: табиғи генді тікелей бөліп алу (сирек мумкіндік), химиялық және ферменттік синтез. Табиғи генетикалық материалдан, яғни ДНҚ-дан арнайы ферменттердің (рестрикциялық эндонуклеазалардың) көмегімен қажет ген «кесіліп» алынады. Бұл әдістің елеулі кемшіліктері бар. Біріншіден, ДНҚ-дан қажет генді танып, кесе алатын ферментті таңдап алу қиын. Фермент генді әрқашанда нақты шекарасында емес әр қилы үзеді: не геннің екі жағынан артық нуклеотидтерді үзуі, не түгел үзбеуі мүмкін. Мұндай ДНҚ фрагменттерінің қызметі жеткіліксіз, сондықтан оларды пайдалану мүмкін болмайды. Екіншіден, эукариоттық организм геномының экзон-интрондық құрылысы олардың гендерін бактерияларға енгізгенде функциялық тұрғыдан қиындық туғызады. Өйткені бактериялық жасушада сплайсинг процесі (интрондардың кесілуі) өтпейді. Үшіншіден, егер ген барлық ДНҚ-ның аз ғана бөлігін құраса, онда оны бөлу мен анықтауда елеулі қиындықтар пайда болады. Сондықтан бұл әдіс негізінен генетикалық эксперименттер талабына сәйкес вирус пен бактериялардың генін бөлуде қолданылады. Генді синтездеудің химиялық әдісі. Бұл әдісте ақуыздың немесе полипептидтің бірінші құрылымы (амин қышқылдар қатары) белгілі болса, оның генінің нуклеотидтер қатары химиялық жолмен синтезделеді. Берілген нуклеотидтер тізбегі бойынша ДНҚ синтездеу әдісін 1969 жылы, ген инженериясының дәуірі басталмаған кезде-ақ, Г. Корана ұсынған болатын. Ашытқы тРНҚ-ның гені осылай синтезделді. Бұл ген 77 н. ж.-тан құралған. Алдымен, ұзындығы 5—12 нуклеотидтерден тұратын ДНҚ-ның қысқа фрагменттері синтезделді, онан соң олар арнайы ферменттің (лигаза) әсерімен бір-бірімен жалғанды. Алайда, алғаш синтезделген бұл генді ішек таяқшасының жасушасына енгізген кезде жұмыс істей алмады, өйткені онда реттеуші элементтер — промотор және терминация бөліктері жоқ болатын. Кейін, 1976 ж. Г. Корана қызметкерлерімен тирозиннің тРНҚ-сының генін синтездей алды. Геннің ұзындығы 126 н. ж.-қа тең болды, оған 52 н. ж.-тан құралған промотор, 21 н. ж. -тан құралған — терминатор және ұштарына тетрануклеотидтер (ААТТ және ТТАА) жалғанды. Нәтижесінде, осы генді бактериофаг арқылы Е. Со1і жасушасына енгізгенде олар өз функциясын керсете алды. Қазіргі уақытта Г. Корана өңдеген әдістер бірқатар жасанды гендерді синтездеу үшін қолданылады. Осындай жолмен адамның — инсулин және интерферон, адам мен жануарлардың — энкефалин және брадикинин гормондарының функциялы гендері синтезделді. Қазіргі кезде гендерді автоматты синтездейтін аппараттар бар. 1980 ж. Итакура алғаш өзінің құрамында алдын ала берілген тізбек бойынша 6 сағ. ішінде 12-мүшелік олигонуклеотидті синтездеуге қабілетті автоматтың жұмысын компьютер бақылады. Мұндай жабдықтардың 1982 жылғы бағасы 36000—39500 долларға тең болатын. Егер 1979 жылы 120 н. ж.-тық генді синтездеу үшін екі жыл керек болса, 1981 ж. бұл мақсатқа үш-ақ күнде жетуге мүмкіндік болды. Генді синтездеудің ферменттік (энзимдік) әдісі. Генді синтездеудің үшінші әдісі кеңінен таралған және кейін рекомбинантты ДНҚ күйінде бір, кейде көп жасушалы организмдерде көбейетін гендердің негізгі шығу көзі болып саналады. Бұл әдіс бойынша алдымен жасушалардан (мұнда, қажет геннің активтілігі жоғары болуы керек) информациялық (матрицалық) РНҚ (иРНҚ, мРНҚ) молекулалары бөліп алынады, олардың арасында ген коделейтін иРНҚ да бар. Бұдан кейін кері транскриптаза (ревертаза) ферментінің көмегімен бөліп алынған иРНҚ-ның бойында комплементарлы ДНҚ (кДНҚ) синтезделеді. Кері транскрипция процесінде матрицалық иРНҚ-да кДНҚ-ның синтезі басталуы үшін иРНҚ-ның 3'— ұшына комплементарлы «ашытқы» - қысқа тізбекті олигонуклеотид қажет. Сонымен қатар, жаңа кДНҚ тізбегі синтезделуі үшін Mg2+ иондары мен дезоксинуклеозидтрифосфаттар керек. Жаңа кДНҚ синтезделіп біткеннен кейін, оны тазалап, ДНҚ-ның екінші тізбегін синтездеу үшін матрица ретінде пайдаланады. Ол үшін ортаға ревертазаны немесе ДНҚ-полимеразаны (бактериялардан алынған) қосады. ДНҚ-ның екінші тізбегінің синтезі басталуы үшін ДНҚ-ның 3'—ұшына комплементарлы олигонуклеотид керек, әйтпесе кДНҚ-ның 3'— ұшы белгісіз себептермен шпилькалы құрылым түзеді. ДНҚ-ның екінші тізбегі синтезделіп болғаннан кейін, оның алғашқы кДНҚ-мен қосылған (шпилькалы) бөлігі нуклеаза Sl ферментінің әсері арқылы ажырайды, нәтижесінде қос тізбекті ген алынады. Оны қос тізбекті комплементарлы ДНҚ (қт-кДНҚ) деп атайды. РНҚ жіпшелері сілтінің әсерімен гидролизденеді, ал олигонуклеотидтер аталған нуклеазаның әсерімен ыдырайды. Кері транскриптаза ферменті арқылы синтезделген гендерді бактерия жасушасына енгізбестен бұрын оларға реттеуші элементтер жалғанады. Сонымен қатар, прокариоттарда сплайсинг жүрмейтіндіктен генді ферменттік жолмен синтездеу үшін матрица ретінде гяРНҚ-ны емес, жетілген иРНҚ пайдаланылады. жүктеу/скачать 2,07 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|