А. Д. Нурахова, Л. Т. Ералиева клиникалық лабараториялық диагностика бойынша ұлттық Әдістеме
жүктеу/скачать 1,76 Mb.
|
КДЛ бойынша ұлттық әдістеме
Талдау көрсеткіштері: 1. В гепатитінің вирусына, оның ішінде вакцинацияға дайындық кезінде қорғаныштық иммунитеттің болуын анықтау; 2. Вакцинацияның тиімділігін растау; 3. В вирустық гепатитіндегі иммундық жауаптың бағасын бағалау. Мәндерді ұлғайту: 1. В гепатитіне қарсы ұтымды вакцинация; 2. Жедел гепатит B: қалпына келтіру фазасы; 3. Созылмалы гепатит B төмен инфекциямен (кейде). Анықтамалық мәндер ішінде: 1. B гепатитінің болмауы (егер В гепатитінің басқа маркерлерін зерттеу нәтижелері теріс болса); 2. Жіті В гепатитін алып тастаудың мүмкін еместігі: инкубация немесе жедел кезеңдер; 3. Созылмалы гепатит В гепатитін жоғары жұқтыруға жол бермеу; 4. Төменгі репликациямен ГБ-антигенді тасымалдауды жоюдың мүмкін еместігі; 5. Вакцинациядан кейінгі сауалнама кезінде: вакцинацияның әсері болмауы.
HBcoreAg (Ig М және Ig G) антиденелерін анықтау, кейінге өткерген немесе ағымдағы гепатит В гепатитін көрсетеді. Анықтау әдісі: Ахсум, сапалы тест. Мерзімі: 1 күн. Зерттеуге дайындық: талап етілмейді. Тестілік материал: қан сарысуы. Тағайындауға арналған нұсқаулар: 3. Ағымдағы немесе өткен В гепатитін анықтау; 4. Жіті және созылмалы гепатит В бақылауын бақылау.
Теріс нәтиже: 1. В гепатиті анықталмаған (В гепатитінің басқа маркері болмаған кезде); 2. Жедел В гепатитін алып тастаудың мүмкін еместігі - инкубациялық кезең; 3. Сирек: В гепатиті бар науқастарда иммунитеттің өте нашар көріністері болмау мүмкіндігі. HB-core антигеніне Ig M антиденелер В вирустық гепатитінің өткір фазасында анықталады және инфекциядан кейін 6 ай немесе одан көп уақыт бойы сақталады. Бұл маркер сонымен қатар гепатит В вирусының созылмалы тасымалдаушыларында (аз мөлшерде) кездеседі. Осы кезеңде анти-HBc Ig M антиденелері - гепатит В вирусымен өткір инфекцияның жалғыз нақты көрсеткіші. Анықтау әдісі: ИФА, Aхsym, сапалы тест. Мерзімі: IFA - 1-4 күн, Ахысым - 1 күн. Зерттеуге дайындық: талап етілмейді. Тестілік материал: қан сарысуы. Тағайындауға арналған нұсқаулар: 1. В гепатитінің жедел диагнозы, созылмалы В гепатитінің реактивациясы; 2. созылмалы гепатит В гепатитінің жүруін бақылау.
Оң нәтиже: 1. Жіті гепатит B; 2. Созылмалы гепатит B (кейбір жағдайларда). Теріс нәтиже: 1. В гепатиті анықталмаған (В гепатитінің басқа маркері болмаған кезде); 2. Жедел гепатит B: инкубация кезеңі мен қалпына келтіру кезеңін алып тастау мүмкін еместігі; 3. созылмалы гепатит В гепатитін болдырмаудың мүмкін еместігі. Гепатит В-вирусының HB-core антигеніне Ig G класының антиденелері Гепатит B вирусының HBe антигені В гепатитінің вирусын белсенді түрде репликациялауды белгілер. HBeAg - гепатит В вирустық антигені, HВcoreAg вирусының бұзылу өнімі. Инкубациялық кезең аяқталғаннан бастап HBsAg пайда болғаннан кейін виремия кезеңінде В гепатитімен науқастың қанында кездеседі. Бұл кезеңде гепатит В вирусының ДНҚ-ы ПТР-мен анықталады. HBsAg анықталған жағдайда, бұл маркерді бірден анықтағаннан кейін, HBsAg қатысуымен қандағы бұл антигенді әрдайым вирустық гепатит B-нің өткір немесе созылмалы түріне қатысты қорытынды жасауға болмайды, сондықтан осы зерттеуді HBsAg-позитивті пациенттерде жүргізу ұсынылады. Анықтау әдісі: ферменттік иммундық құбылыс. Aхsym мүмкіндіктерін оған қосыңыз. Сапалы тексеру. Мерзімі: 1-3 күн. Зерттеуге дайындық: талап етілмейді. Тестілік материал: қан сарысуы. Талдау көрсеткіштері: 1. жедел және созылмалы В гепатитінде патологиялық процесті бағалау; 2. HBs-позитивті науқастармен байланыс кезінде вирустық тасымалдау тәуекелін бағалау. Нәтижелерді интерпретациялау: HBeAg үлгісінде анықталған кезде жауап «оң», ал болмаған кезде жауап «теріс». Өте төмен құндылықтарда («сұр аймақ») жауап «күмәнді, 10-14 күн өткеннен кейін зерттеуді қайталау ұсынылады». Оң нәтиже: вирус жоғары репликация жылдамдығы жоғары жедел немесе созылмалы гепатит. Теріс нәтиже: 1. Репликацияның қарқындылығы төмен жедел немесе созылмалы гепатит; 2. Қалпына келтіру немесе инкубациялау кезінде жедел гепатит; 3. В гепатиті анықталмады (B гепатитінің басқа маркерлері болмаған кезде). Гепатит B вирусының HBe антигеніне Ig M және Ig G дәрілерінің жалпы антиденелері. Жедел гепатит B, ремиссия жылдамдығы. HBeAg-ге қарсы жедел гепатитке қарсы антиденелердің пайда болуы осы антигеннің қанынан (көбінесе сарғаю кезеңінің 2-3-ші аптасында) жойылғаннан кейінгі кішігірім алшақтықпен байқалады. HBeAg сияқты анти-HBe анықтауы инфекциялық процестің динамикасын тек HBsAg-позитивті пациенттерде бақылайды. Жедел гепатит B курсының 9-шы аптасының соңына қарай бұл антиденелерді пациенттердің 90% -ы анықтайды. HBeAg-анти-HBe-дің (HBe-антигеннің жоғалуы және оның антиденелерінің пайда болуы) сероконверсиясы AЛТ белсенділігінің артуымен, кейде өршудің клиникалық көріністерімен біріктірілуі мүмкін. Анти-HBe антиденелері 2-5 жыл ішінде қан айналымы, кем дегенде - бірнеше ай. Әдетте олар қалпына келтіру процестерімен байланысты болса да, anti-Hbe антиденелерді гепатит В вирусының созылмалы асимптоматикалық тасымалдаушыларында анықтайды. Анықтау әдісі: Ахсуm ерекшеліктері оған әсер етеді. Сапаны тексеру. Мерзімі: 1 күн. Зерттеуге дайындық: талап етілмейді. Тестілік материал: қан сарысуы. Талдау көрсеткіштері: 1. Жедел және созылмалы В гепатитінің барысын қадағалау; 2. Вирусқа қарсы терапияның тиімділігін бақылау. Нәтижелерді интерпретациялау: анти-HBe антиденелерін анықтаған кезде жауап болмаған жағдайда «оң», ал «теріс». Оң нәтиже: 1. Жедел гепатит B, қалпына келтіру фазасы; 2. созылмалы гепатит B; 3. В гепатитінің вирусын созылмалы асимптоматикалық тасымалдау. Теріс нәтиже: 1. Гепатит B вирусымен бұрын инфекция болмаған жағдайда; 2. Жедел В гепатитін алып тастаудың мүмкін еместігі - инкубация немесе өткір кезеңдер; 3. Созылмалы В гепатитін алып тастаудың мүмкін еместігі; 4. Төмен репликациямен HBs -антигенді алып тастаудың мүмкін еместігі. Вирусты гепатит ИФА арқылы кеңінен анықталады. Басқа әдістермен салыстырғанда, ИФА келесі оң ерекшеліктерге ие: • 0,1 нг / мл дейін концентрациядағы қажетті затты анықтауға мүмкіндік беретін жоғары сезімталдық; • зерттелетін материалдардың минималды көлемін пайдалану мүмкіндігін (1 мкл); • сақтау тұрақтылығы (реагенттерді сату мерзімі 4 айдан 1 жылға дейін) • экспресс жылдамдығы (жылдамдықты талдау) • реакцияның барлық кезеңдерін автоматтандыру мүмкіндігі Бұл әдіс келесідей принципке негізделген ферментті иммундық әдіспен (ИФА) негізделеді: қатты фазалық тасымалдаушыда (ішкі сынақ жүйелерінде және шетелде жасалған көптеген сынақ жүйелерінде тасымалдаушы ретінде полистирол таблеткасының тасымалдаушысы қолданылады) , Антиденелерді анықтау керек. Сорбент (қатты фаз) - полистирол, проливвинил хлориді, акрил, полиметил метакрилат және басқалары сияқты әр түрлі пластмасса қолданылады. Олар келесі талаптарға жауап береді: • талдаудағы ерімейтінтіндер; • жоғары сорбциялық сыйымдылық (1,5-4 нг / мм3) • ақуыздың байланыстың беріктігі мен сақтау тұрақтылығы; • байланыстыру қабілеті тән емес; • нәтижелердің қайталануы (12% -дан аспайтын) Қатты тасымалдағыштың бетіне иммобилизденген антиген иммуносорбент деп аталады. Әдетте, дайын иммуносорбент сынақ жүйесінің жинағына кіреді. Иммуносорбент алу, яғни бірінші реагенттің қатты фазаға қосылуы үш жолмен жүзеге асырылуы мүмкін: - гидрофобты немесе сутек байланыстарына байланысты қатты фазаға антиденелерді (антигендерді) тiкелей бекiту арқылы жеке сорбциялау тәсiлiмен; - глутаральдегид, бром циан, гидрозин және т.б. сияқты реагенттердің көмегімен нақты реагенттің қатты фазаға ковалентті байланыстыру арқылы химиялық сорбциялау арқылы. - жеке реагенттермен химиялық байланысты (мысалы, глутаральдегид көмегімен) жоғары физикалық сорбциялық сыйымдылығы бар заттардың тіркесімін қолдану арқылы аралас сорбция әдісімен (мысалы, іркіт сарысу альбумині). Талдау кезінде ұңғымаларда пайда болатын иммунологиялық реакция схемасы суретте көрсетілген (5-сурет). 5-сурет. Иммуноглобулиндер үшін иммуноанализ сынып G (IgG) 1 - БАҚ (ұңғымалардың беті); 2 - антиген; 3 - сарысудағы ерекше IgG; Иммунозорбцияның сынау сарысуымен антиденелердің антигендерін бар болған кезде инкубациялау кезінде олар «антиген-антиденелер» кешеніне байланады. Енгізілмеген иммуноглобулиндерді алып тастағаннан кейін, адамның иммуноглобулиніне (коньюгат) ферментпен таңбаланған антиденелермен инкубация жасалады, оның барысында ферменттелген таңбаланған антиденелер (жүгері пероксидазы көбіне фермент ретінде пайдаланылады) қолданыстағы антиген-антиденелер кешендеріне қосылады. Конъюгат - белгілі бір реагент бар фермент кешен - антиденелер немесе антигендер. Біріктірілген өндіріс үшін қолданылатын ферменттер: peroxidase, beta-galactosidase, сілтілі фосфатаза, глюкозидаз болуы мүмкін. Конъюгат алу үшін, яғни ферментті антиденелермен немесе антигендермен байланыстыру түрлі әдістерді қолданады: - иммунохимиялық байланыстыру әдісі - фермент пен ферментке ерекше антиденелер арасындағы иммундық комплексті қалыптастыру, содан кейін анти иммуноглобулиндерге байланысты қатты фазада иммунохимиялық кешенге бекітіледі; - Химиялық байланыстың әдісі - фермент молекуласында жаңа реактивтік (альдегид) топтардың пайда болуына негізделген және олардың иммундық реагенттермен өзара әрекеттесуіне негізделген мерзімді тотығудың нұсқасы, сондай-ақ - глутаральдегидті пайдаланып араласқан ингредиенттердің аминогрупптарының химиялық қосылыстары нұсқасы; - химиялық модификациялау әдісі (нақты реагенттер мен ферменттер өздерінің арасында жоғары байланысы бар тұрақты мәнге ие арнайы емес реагенттермен, мысалы, авидин биотинмен модификацияланған) Субстрат ерітіндісімен инкубация кезінде ажыратылмаған конъюгатты алып тастағаннан кейін, фермент субстратпен өзара әрекеттеседі, нәтижесінде қарқындылығы ілеспе сарысу антиденелерінің санына байланысты болады (пероксидазды коньюгатты қолданғанда, сутегі асқыны субстрат ретінде пайдаланылады орто-фенилендиамин (OPD), 5-аминосалицил қышқылы (5-АСА) немесе тетраметилбензидин (ТМБ)). Субстрат - коньюгаттың ферменттік белсенділігінің көрсеткіші. Субстраттың ферментативті трансформациясының өнімі жаңа физикалық-химиялық параметрге ие болуы керек, ол оны анықтауды жеңілдетеді. Ферментативті конверсия өнімінің табиғатына байланысты субстраттар үш түрге бөлінеді: - хромофорлық субстраттар (OFD, TMB, 5-аминосалицил қышқылы және т.б.). Ферменттің әсерінен олардың айналуы өнімдері өзгереді. Көрнекі және аспаптық есепке алу реакциялары. Бұл субстрат типі кең қолданысқа ие болды; - флуоресцентті субстрат (tyramine, гидро-phenylpropionic қышқылы, және т.б.). флуорохромами ферменттік айырбастау мынадай және олардың флуоресцен айқындалады; - Хемилюминесцентный субстрат (luminol, isoluminol). Ферментативті трансформациядан кейін олардың химилюминесценциясы анықталады. Мұндай талдау жүйелерінде қолданылатын қоспа поликлональные түрге қарсы антиденелер (адам иммуноглобулин қарсы мысалы қоян антидене) негізінде немесе белгілі бір сыныпта (М, G, А) адам иммуноглобулин қарсы бағытталған моноклоналды антиденелерді негізделуі мүмкін. Осы қағидаға сәйкес әртүрлі инфекцияларды диагностикалауға арналған ИФА сынау жүйелері (ВИЧ-инфекциясы, вирустық гепатит, цитомегаловирус, герпес, токсоплазмалар және басқа инфекциялар), соның ішінде ЖЖБИ-нің негізгі бөлігі салынды. Сонымен қатар, сәл өзгеше схеманы қолданатын сынақ жүйелері бар (6-сурет) - тіркелген антиденелермен ИФА. 6- сурет Иммуноглобулиндер үшін иммуноанализ класс M (IgM) 1 - БАҚ (ұңғымалардың беті); 2 - анти IgM антиденелеріне қарсы моноклоналды; 3 - IgM сарысуы; 4 - жүгері пероксидазымен (коньюгатпен) таңбаланған антиген. Бұл қатты фазалық тасымалдаушыға бекітілген белгілі бір класс (IgM, IgG немесе IgA) адам антиденелерімен арнайы әрекет ететін аффинді тазартылған антиденелерге негізделген. Сынақ сарысуымен инкубация нәтижесінде бұл кластағы антиденелер тасымалдаушыға байланады. Кез келген антигенге (мысалы, тронемальға) тән антиденелердің болуы антигенмен инкубация кезінде анықталады, ферментпен белгіленеді. Субстратпен инкубация кезінде, үлгіде арнайы антиденелер болған кезде, ерітіндінің бояуы дамиды. Осы схемаға сәйкес, мысалға, Captia Syph G EIA және Captia Syph M EIA коммерциялық сыртқы сынақ жүйелері тиісінше, сифилиз қоздырғышына G және M класстарын антиденелерді анықтауға арналған. ИФА 3 схема арқылы (сурет 7) кейбір сынақ жүйелері қолданылады 7-сурет. Жалпы антиденелерге арналған ферментті иммунды схема 1 - БАҚ (ұңғымалардың беті); 2 - антиген; 3 - ерекше IgG; 4 - ерекше IgM; 4 - жүгері пероксидазымен (коньюгатпен) таңбаланған антиген. класына тәуелсіз антигенге тән жалпы антиденелерді анықтау. Оның мәні сарысудағы арнайы антиденелердің бір мезгілде бір фазалық тасымалдаушыға бекітілген антигенмен және бір мезгілде сарысу мен конъюгатты инкубациялау кезінде ферментпен белгіленген антигенмен өзара әрекеттесу фактісі болып табылады. Антигендерді анықтауға байланысты, барлық антиденелерді анықтауға арналған ИФА сынау жүйелері келесіге бөлінеді: 1) қатты фазада немесе конъюгаттың құрамында иммобилизденген антиген ретінде лизат - жергілікті антиген (лизис немесе мәдениетте алынған уландырғыш инфекциялық агент) 2) рекомбинантты - гендік инженерия әдісімен алынған протеиндер - патогеннің белгілі белоктар антигендерін аналогтары; 3) пептид - химиялық синтезделген ақуыздың фрагменттері. ИФА диагностикасының дамуының жалпы бағыты лизат тестілеу жүйелерінің бірі болып табылады, олар әдетте бірінші буын сынау жүйелері деп аталады, рекомбинантты және пептидке бағытталған. Лизатты сынау жүйесінің сапасын анықтайтын негізгі факторлар - патогеннің антигендік сипаты және лизатты қоспалардан тазарту сапасы. Мысалы, мерезге қатысты бірінші фактор ерекше маңызды. Бозғылт спирокетаның антигендік табиғаты тек оған ғана тән. Ромбинаттық ақуыздарды өндіру технологиясы кез-келген жеке антигеннің ұқсастығын жеткілікті таза түрде алуға мүмкіндік береді. Жоғары сапалы рекомбинантты сынау жүйесін жасау үшін келесі талаптарға жауап беретін патогеннің антигендік әртүрлілігінен антигендерді таңдау керек: 1) олар өте иммуногенді болуы керек, яғни, денеде жұқтырған адам антиденелерді шығару керек бұл антигендерге өте көп мөлшерде; 2) осы антигендерге қарсы антиденелер аурудың барлық кезеңінде пациенттің қанында анықталатын мөлшерде болуы тиіс; 3) бұл антигендер өте ерекше болуы керек, яғни, бұл патогендік үшін ғана тән және басқа табиғаттың антиденелерімен өзара реакцияларды бермейді. Бұдан басқа, рекомбинантты ақуыздардың тазалық сапасы өте маңызды. Керемет жағдайда (егер жоғарыда келтірілген талаптардың барлығы орындалған болса) 100% дерлік спецификамен және жоғары сезімталдықпен рекомбинантты сынау жүйесін алуға болады. Іс жүзінде бұл әрқашан қол жеткізе бермейді, бірақ үздік рекомбинанттық тест жүйелерінің ерекшелігі 100% -ға жуықтайды. ИФА сынау жүйесінің сапасының негізгі көрсеткіштері: • сезімталдық; • ерекшелік; • қабылдаушылық. Сезімталдық - тексерілген науқастардың жалпы санының осы сынақ жүйесінде оң нәтиже алған науқастардың үлесі (мысалы, мерез). Спецификасы - сау тексерілетін адамдардың жалпы санынан осы жүйеде теріс нәтиже алған сау адамдар үлесі. «Сезімталдық» және «ерекшелігі» ұғымдары «жалған теріс нәтиже» және «жалған оң нәтиже» ұғымымен тығыз байланысты. Жалған теріс нәтиже бұл сынақ жүйесінде шын мәнінде оң нәтиже беретін теріс нәтиже болып табылады. Жалған жағымды нәтиже - сынамадағы сынама жүйесінде алынған оң нәтиже, ол шын мәнінде теріс. Осылайша, неғұрлым сезімтал - жалған-теріс нәтижелерді азайтатын сынақ жүйесі, ал жалған-оң нәтижелерді азайтатын неғұрлым нақты болып табылады. Диагностика үшін сынау жүйелерінің сезімталдығы, мысалы, сифилис, сырдың сенімді диагнозы бар науқастардан алынған (қаныққан клиникалық деректерге және серологиялық нәтижелерге негізделген) қан сериінің үлгісі бойынша бағаланады. Неғұрлым көп үлгілер пайдаланылды, бұл көрсеткішті неғұрлым нақты бағалау. Бұл формула бойынша есептелген кезде сынақ жүйесінің сезімталдығы: H = P / S100%, онда P - бұл сынақ жүйесінде оң нәтиже беретін үлгілердің саны, S - зерттелген оң үлгілердің жалпы саны. Сынақ жүйесінің өзіндік ерекшелігі де сау адамдарға арналған қан сарысуын жинаумен қатар бағаланады. Алайда, олардың мерездің болмауы сезімтал серологиялық сынақтардың теріс нәтижелерімен расталуы керек (мысалы, ҚТС). Ерекшелігі формула бойынша есептеледі: C = N / S100% мұнда N - бұл сынау жүйесінде теріс нәтиже беретін үлгілердің саны, S - зерттелген теріс үлгілердің жалпы саны. ИФА сынау жүйелерінің ерекшелігін бағалау кезінде олардың жоғары сезімталдықты ескеру қажет. Егер «теріс» іріктеу үлгісін құрайтын үлгілерді сынақтан өткізген болсаңыз, кез-келген үлгі үшін оң нәтиже алса, оны жалған-позитивті деп қарастырар алдында қосымша зерттеулер жүргізу қажет. Vosproizvodimost' — sposobnost' test-sistemy davat' ustoy¬chivo stabil'nyy rezul'tat pri mnogokratnom testirovanii odnogo i togo zhe obraztsa. Pri etom imeyet znacheniye kak vosproizvodimost' rezul'tata vnutri odnogo plansheta (pri vnesenii issleduyemogo obraztsa v raznyye lunki), tak i vosproizvodimost' rezul'tata pri testirovanii obraztsa s ispol'¬zovaniyem raznykh diagnosticheskikh naborov (odnoy ili raznykh seriy). Vosproizvodimost' yavlyayetsya pokazatelem stabil'nosti kachestva test-sistemy — chem vyshe dannyy pokazatel', tem nadezhney test-sistema. Өрбу қабілеттілігі - тестілік жүйенің бірдей үлгіні қайта сынақтан тұрақты тұрақты нәтиже беру мүмкіндігі. Бұл жағдайда әртүрлі диагностикалық жинақтарды (бірдей немесе әртүрлі сериялар) пайдалана отырып, сынақты сынақтан өткізу кезінде бір таблеткадағы (сынақ үлгісі әртүрлі ұңғымаларға қолданылған кезде) және нәтиженің репродукциялылығында нәтиженің қайталануы маңызды. Өрбу қабілеттілігі - бұл сынақ жүйесінің сапасының тұрақтылығының индикаторы - бұл көрсеткіш неғұрлым жоғары болса, сынақ жүйесі неғұрлым сенімді. Егер тестілік жүйе сапалы талдау үшін (скрининг ретінде) пайдаланылса, онда нәтиже оптикалық тығыздығының абсолюттік мәніне қарамастан, тек «оң» немесе «теріс» нәтижелерді ойнату маңызды. Бұл жағдайда репродукциялық бағалау сарысулардың белгілі бір үлгісінде жүргізіледі (осы үлгідегі үлгілердің көбісі сол пластинаның әртүрлі ұңғымаларында және сынақ жүйесінің әртүрлі жиынтықтарында сыналған, әлсіз оң және төменгі шекті теріс нәтиже, неғұрлым дәл бағалау береді). Сонымен бірге, дәлірек бағалауды алу үшін, бір зертханалық техниктің «қолдарымен» бір мезгілде талдау жүргізу керек. Өрбу қабілеттілігі формула бойынша есептеледі: S x K - M B = S x K x 100%, мұнда S - пайдаланылатын үлгілер саны, K - қайталау саны, M - ойнатылмаған нәтижелердің саны Мысал. 10 іріктеме үлгілері 5 рет қайталанады. Бұл жағдайда 4 жағдайдағы бір нашар оң сынама оң нәтиже берді, ал 1 жағдайда теріс және бір теріс үлгі 3 жағдайда теріс нәтиже көрсетті, ал 2 жағдайда оң нәтиже берді, ал қалған нәтижелер 5 есе көбейтілді. Сынақ жүйесінің ревизиясы келесідей болады: 10x5-3 B = 10x5 x 100% = 47/50 х 100% = 94% Егер сынау жүйесі антиденелердің титрін (жартылай сандық талдау) анықтау үшін пайдаланылса, сынақ жүйесіндегі әртүрлі жиынтықтарда (әртүрлі серияларды қоса алғанда) анықталған кезде үлгідегі антиденелердің кернеу шамасын көбейту маңызды болып табылады. Бұл инфекциялық процестің динамикасын бақылауда маңызды (мысалы, емдеуден кейін). Бұл жағдайда репродукцияны сынау жүйесінің бірнеше жиынтығындағы (кемінде екі) бір үлгі үшін антиденелердің титерін анықтау арқылы бағалауға болады. Осылайша, әрбір диагностикалық зертханада ұсынылған сынақ жүйелерінің сапасын бағалауға және үздіксіз жұмыс үшін ең жақсы таңдауды таңдауға мүмкіндік бар. Сондай-ақ, белгілі бір сынақ жүйесімен үнемі жұмыс жасай отырып, алынған нәтижелердің сенімділігі мен сенімділігін арттыратын сапасын үнемі бақылап отыру ұсынылады. ИФА жүзеге асырылатын зертханалар төмендегілермен жабдықталуы тиіс: - 5-40, 40-200 және 200-1000 мкл сұйық мөлшерлеуге арналған бір арналы ауыспалы көлемді тамшуын қамтитын автоматты тамшуырлар жиынтығы (microbatchers), сондай-ақ 5-50 жән - өлшемді химиялық заттар жиынтығы; - температура 37 ° C температурасын ұстауға арналған термостат; - тоңазытқыштың мұздату құрылғысы; - Дистилляция алу үшін зертханалық дистиллятор су; - Спектрофотометрлік таблетка (оқырман). Сонымен қатар, түрлі шетелдік және отандық фирмалар ELISA орнату барысында кейбір процедураларды жеңілдетіп, жеңілдете алатын жабдықтарды ұсынады.е 50-ден 8 арналы ауыспалы көлемді тамшуырлар -200 мкл; Осындай жабдықтардың ішіне кір жуғыш машиналарға - планшеттік шайбаларға ерекше назар аудару керек. Оларға вакуумдық сорғаға қосылған 8-немесе 12-арналы «g-бенок» қолжазбаларының толық автоматтандырылған бағдарламаланатын қондырғыларына түрлі нұсқалар бар. ИФА орнату кезінде сенімді нәтижелерге жету үшін төмендегі талаптар мен ұсыныстарды сақтау қажет: 1. Сынақ жүйесін пайдалану жөніндегі нұсқаулықты қатаң сақтау. Әдетте, осы нұсқаулықты пайдалана отырып, оның барлық ерекшеліктерін ескере отырып, ИФА-ны жүргізу кезінде дұрыс нәтижелер алу үшін маңызды ұстанымдар қарастырылады. Ең көп тараған бұзушылықтар: - инкубация уақытын ТМБ (CRF) ерітіндісімен өзгерту; - планшеттің жуғыш заттар санын және жуу әдісін өзгерту. 2. Сынақ жүйесінің жинақтары мен жекелеген компоненттерін сақтау шарттары мен талаптарын сақтау. Диагностикалық жинақтардың жоғары сапалы өндірісі өндіруші тарапынан белгіленген сақтау мерзімі ішінде және сақтаудың талаптары сақталған жағдайда кепілдендіріледі. Кейде арнайы жинақтардың сақтау мерзімі тұтынушының өтініші бойынша өндіруші тарапынан ұзартылуы мүмкін. Мұндай шешім өндірушінің осы сериялардың жиынтығын бақылауды тексеру негізінде жасалады және жазбаша бұйрықпен расталуға тиіс. 3. Жабдықты кезеңдік бақылау. ИФА сапасына әсер ететін өте маңызды фактор және сенімді нәтиже алу - жабдықтың дәлдігі. Сондықтан автоматты пипеткалар, термостаттар, спектрофотометрлер және ілгіштердің жұмысын мезгіл-мезгіл бақылау керек. 4. Ыдыс-аяқты жоғары сапалы дайындау. Ыдыс-аяқтарды жуғыш заттармен (био-қоспаларсыз) жақсы жуып, ағын сумен мұқият шайып, содан кейін тазартылған сумен жуыңыз. Автоматты тамшуыр ұштары бір рет пайдаланылуы керек. Егер бұл мүмкін болмаса, оларды 3-6% сутектік пероксид ерітіндісіне бір түнде сіңіріп, бірнеше сағат бойы ағын сумен жуыңыз, содан кейін тазартылған суды 15-30 минут қайнатыңыз, қайтадан тазартылған сумен жуып, 50% алкоголь ерітіндісі, содан кейін құрғақ. ОПД шешімімен жұмыс істеу үшін спирт пен тазартылған сумен шаюға болады. Атап айтқанда, тазалыққа жоғары талаптар қойылуы керек. ыдыстар мен шешімдерді өңдеуге арналған кеңестер конъюгаттар, өйткені олар тіпті шағын ластану әкелуі мүмкін коньюгаттың белсенділігінің төмендеуіне және, тиісінше, орындалатын талдаудың сезімталдылығының төмендеуіне алып келеді. 5. Сыналған үлгілерді дұрыс дайындау. Жаңадан дайындалған сарысу үлгілерін (плазманы) сынау қажет. Егер бұл мүмкін болмаса, онда: а) тоңазытқышта үлгілерді 4 ° C температурада сақтау үшін 5 күнге дейін; б) дереу мұздату (бұл жағдайда үлгілерді қайта мұздатуға және ерітуге жол берілмейді). Сынақ үлгісі мөлдір болуы керек, гемолиздің, ауыр гиперлипидемияның (hyleoza), бактериемияның белгілері болмауы керек. Бір сарысудың микрокразиясының тіпті басқа біреуіне түсу мүмкіндігін болдырмау керек. түтік ұстағыш үстінен және жұмыс үстелінен жоғары сарысуды ешқандай манипуляция жасамаңыз, әр үлгі үшін жеке тамшуыр ұшымен пайдаланыңыз. 6. Әртүрлі сериядан тұратын компоненттерді араластыру мүмкіндігін жою. Ешбір жағдайда сынақ жүйесінің барлық компоненттері және талдау шарттары (атап айтқанда, коньюгаттың жұмыс разбавления) өндірушінің әр жиынтығы үшін жеке-жеке таңдағандықтан, әртүрлі сериялардың компоненттерін араластыруға жол берілмейді. 7. Лабораторияның жұмысына көңіл аудару және назар аудару, талдау жүргізу. ИФА сынақ жүйелері сыналатын көптеген үлгілермен бір мезгілде жұмыс істеуді қамтамасыз ететіндіктен, ұңғымаға салынған кезде шатасуы болуы мүмкін.Бұл мүмкіндікті барынша азайту үшін анализ басталғанға дейін зерттеу хаттамасын толтыру ұсынылады, онда үлгілердің ұсынылған реті планшеттік диаграммада көрсетілуі керек. Бұл схема зертханашыға жұмыс барысында өзін бақылауға көмектеседі. Зерттеудің соңында талдау нәтижелерін хаттамаға енгізу ұсынылады (мысалы, спектрофотометр принтерінен басып шығару). Осылайша, құжат зерттеу туралы ақпаратты сақтауға ыңғайлы болады. 8. Планшетті ИФА әр сатысында мұқият жуыңыз. Жуу режимі сынақ жүйесін пайдалану нұсқауларына қатаң сәйкес келуі керек. Түрлі тест жүйелерінде әр түрлі талаптар бар. Планшетті жуудың сапасы ELISA формуласында шешуші факторлардың бірі болып табылатындығын ескеру қажет, сондықтан ол өте мұқият. Плитаның барлық ұңғымаларын толтыру мен босатудың біртектілігін, толтыру деңгейін (ұңғыманы жақсырақ толық толтыру) қадағалау керек, планшетті құрғатуға арналған сүзгі қағазын немесе дәкеді тұрақты түрде өзгерту керек. Қайталанатын ispol¬zovanii жуғыш қолданбай sinte¬ticheskih оны жуып, оның дезинфекция орнына хлорамин сутегі pe¬rekisi ерітіндісінде жүзеге асырылуға тиіс дәке. 9. ықтимал жағымсыз әсерлерді TMB (ХПН) жұмыс. - Ол материалдар сутегі асқын немесе спирт ерітіндісі өндіруге vspo¬mogatelnyh осы пайдалану жеке ыдыс және тамшуыр кеңестер, дезинфекциялау және құралдар үшін, синтетикалық жуғыш және хлорамин тіпті аз kon¬takta TMB (CRF) (дайындалған ерітінді, және планшеттер) мүмкіндігін алып тастау қажет; - таблеткалардың контакттары мен металдармен TMB (OPD) ерітіндісінің алдын алу; - жарық әсерін болдырмайды; - тек TMB (CRF) жаңа дайындалған ерітіндісімен жұмыс істеңіз (қолдануға дейін 20 минуттан артық емес). Тікелей пайдаланудан бұрын OPD шешім мөлдір және түссіз болуы керек. 10. ТМБ инкубациялаудың температуралық режиміне сәйкестігі. Нұсқауларға сәйкес, ТМБ ерітіндісінің инкубациясы бөлме температурасында болуы керек. Стандартты бөлме температурасының (18-25) ° C екендігін ескеру қажет. Бұл нұсқаулықта көрсетілген инкубация ұзақтығы есептелген осындай температура диапазонында. Бөлмедегі температура 18 ° C төмен болса, ферментативті реакция баяулайды, бұл талдаудың сезімталдылығының төмендеуіне әкелуі мүмкін. Бұл жағдайда ТМБ (OFD) инкубациясын (20-25) ° C температурадағы термостатта орындау ұсынылады. Автоматты пипеткалар. ИФАны орындаған кезде автоматты құбырлармен өлшеу көлемінің рұқсат етілген қателігі 5% -ды құрайды. Қолданылған тамшуырлар қажетті көлемдер ауқымына сәйкес келуі керек. Талдау кезінде тамшықты пайдаланатын әр операция мұқият бақылануы керек, себебі кез келген қате немесе қате (әсіресе шағын көлемді тасымалдау кезінде) талдау нәтижелерінің дәлдігіне әсер етуі мүмкін. Тамшуырдың дәлдігін гравиметриялық түрде ай сайын бақылауды жүргізудің басты шарты: Ұшы тамшуырға мықтап басылады. Дистилденген су кем дегенде 5 рет құйылады, әр кезде біз сығылған суды ең жақын 0,1 мг-ға дейін салмақ. Орташа көлемде ауыспалы көлемді тамшуырлар орнатылды. Тамшуырдың дәлдігін бағалау кезінде 1 мл судың бөлме температурасында 1 г массасы бар деп есептеледі. Термостаттар. Термостатты сынау жүйесін пайдалану бойынша нұсқаулықта көрсетілген дұрыс температурада ұстау да дұрыс талдау нәтижелерін алу үшін маңызды. Толеранттар - ± 2 ° С. Төмен температураларда талдаудың сезімталдығы төмендейді, ал жоғары температура кезінде ерекшелігі төмендейді. Термостатта орнатылған сыртқы термометрдің көрсеткіштері (егер бар болса) кейде құралдың сөрелеріндегі шынайы температураға сәйкес келмейді. Сондықтан термостаттың жұмысын сынап термометрін оның камерасына орналастырып, әдетте плиталар орналастырылатын деңгейде бақылау керек. Автоматты таблетка шайғыштары (шайбалар). Планшеттің жоғары сапалы, әр жұмыс кезеңінде дұрыс жууы талдаудың табысын айтарлықтай анықтайды. Барлық ұңғымалар талап етілетін көлемде жууға арналған ерітіндіге толығымен толтырылып, толығымен босатылуы керек. Автоматты жуу машиналарын пайдаланған кезде барлық осы параметрлерді бақылау маңызды. Пластинаның барлық ұңғымаларын толтыру мен босатудың біркелкілігі жуу процесінде көзбен бақыланады. Сонымен қатар, ұңғымаларды толтыру көлемі мезгіл-мезгіл қажетті көлемге реттелген тамшуырмен тексеріледі. Автоматты және қолмен жуу машиналарының сапасыз жұмыс істеуін болдырмау үшін жуғыш жүйенің арналарын жуу және ластанудан жуу шешімінің тұзын болдырмау үшін жұмыс аяқталғаннан кейін күнделікті тазартылған сумен жуып тұру қажет. Шлангтарда, каналдарда және цистерналарда микробиологиялық өсудің алдын алу үшін аптасына бір рет кем дегенде аптасына бір рет этил спиртін немесе басқа да дезинфекциялау ерітіндісін 70% ерітіндімен жуу қажет. Егер құрылғы дезинфекцияланбаса немесе көрінетін микробиологиялық өсімдік (әсіресе, шлангтың шлангтарында) табылса, құрылғыны мұқият зарарсыздандыру керек, «шабылған» шлангілерді жаңадан ауыстырыңыз немесе келесі схемаға сәйкес емдеңіз: • шлангтарды құрылғыдан 6% пероксид ерітіндісіне шығарыңыз 6 сағат ішінде сутек, оларды залалсыздандыратын ерітіндімен толтырады; • Дезинфекциялайтын ерітіндіге ұшырағаннан кейін, алдымен түтік суы бар, содан кейін тазартылған сумен (6-8 рет) шлангілерді мұқият жуыңыз; • Жуылған шлангтарды дистилляцияланған табаға салыңыз суды толтырып, 30 минут қайнатыңыз; • салқындатылған суды шлангтардан босатыңыз тазартылған су қажет болса, құрғатыңыз бөлме температурасында немесе 85 o C кезінде 2 сағат ішінде. Қолдануға дайын шлангтар. Планшеттік спектрофотометрлер (оқырмандар, ELISA анализаторлары). Спектрофотометрлер талдау нәтижелерін сандық бағалау үшін пайдаланылады, сондықтан олар мерзімді (жылына кемінде бір рет) метрологиялық бақылауға жатады. Күнделікті тәжірибеде, спектрофотометр жұмыс режиміне жету үшін жылуды қажет ететінін есте сақтау керек (әрбір нақты құралдың жылыту уақыты оның қолданылу нұсқаулығында көрсетілген). Спектрофотометрдің дәлдігін тексерудің қарапайым әдістері бар: а) пластинаның әр ұңғымасына нәтиженің спектрофотометриялық бағалауының репродукциялық болуын тексеру үшін бір планшеттен оқылымның бірнеше рет оқылуын жүзеге асыру қажет. Планшеттің әрбір нақты ұңғымасы үшін алынған оптикалық тығыздықтың рұқсат етілген ауытқуы 10% -дан аспауы керек. б) нәтижелерді бағалаудың біртектілігін бағалау үшін планшеттің бүкіл бетіне спектрофотометр арқылы бос бос планшеттің барлық ұңғыларына біркелкі түсті шешімнің көлемін қосу керек. Осындай ерітіндіні ТМБ ерітіндісіне (CRF) аз мөлшерде пероксидаза қосылысын қосу арқылы (кез-келген ферментті иммунды-зерттеу жүйесінің сынақтарына сәйкес дайындалған) дайындауға болады. Бұл жағдайда коньюгаттың көлемі эксперименталды түрде таңдалады, осылайша оптикалық тығыздық алынған ерітінді 0,3 дан 1,0 пу аралығына дейін болды (оптикалық бірліктер). жүктеу/скачать 1,76 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|