ДНҚ-ның нуклеотидтер қатарын анықтау

68 
кӛмегімен акриламид гелінде бӛлуге болады. Мӛлшері әртүрлі белдеулер 
ұзындығы 300 нуклеотидке дейін жететін «саты» түзеді. 
Бірінші әдісті АҚШ ғалымдары У.Гильберт пен оның шәкірті 
Л.Максам ұсынды. Мұнда қостізбекті ДНҚ үзіндісінің 5'-ұштарын 
радиоактивті фосформен белгілейді. Мұны ішек таяқшасын зақымдайтын, 
Т4 бактериофагынан бӛлінген полинуклеотидкиназа іске асырады. Бұл 
фермент АТФ молекуласынан фосфат тобын ажыратып, полинуклеотидтің 
5'-ұшына жалғайды. Бұдан кейін қос тізбекті ДНҚ-ны денатурациялап, 
ДНҚ-ның жеке тізбектерін гельде электрофорез арқылы айырады. Мұнан 
соң тізбектің әрқайсысын гельден жеке жуып алып, бӛлек зерттейді. Ары 
қарай, үлгілерді тӛрт бӛлікке бӛледі. 
Біріншісіне ДНҚ-ны кез келген аденинді нуклеотидінен кейін үзетін 
ерітінді қосады. Оны ДНҚ тізбегінің бір аденин бӛлігін ғана үзетіндей етіп 
қосу керек. Нәтижесінде тізбекте адениннің әр қилы орналасуына 
байланысты ұзындығы әртүрлі ДНҚ үзінділері пайда болады. 
Дәл осындай жолмен басқа үш бӛлікті де ДНҚ-ны тиминнен, 
гуаниннен және цитозиннен кейін үзетін реагенттермен ӛңдейді. Барлық 
тӛрт үлгідегі ДНҚ үзінділері бір-біріне параллель орналасып, 
полиакриламид гелінде электрофорез арқылы айырады: молекуласы аз 
кесінділер жоғары молекулалы кесінділерге карағанда гельде жылдам 
қозғалады. Мұнда қолданылатын электрофорез әдісі жақсы жетілген, ол 
барлық ДНҚ фрагменттерін ұзындығы бойынша жеке бӛліктерге айыруға 
мүмкіндік береді. Қазіргі кезде ұзындығы 300-ге дейін ДНҚ тізбегінің 
нуклеотидтер катарын анықтаудың ешқандай қиындығы жоқ. 
Геннің нуклеотидтер қатарын оқу үшін қараңғыда гельдің үстіне 
рентген фотопленкасын беттестіреді, мұнда радаоактивті таңба бар 
орындар ғана таңбаланады. Фотопленкада 5'-ұштары белгіленген ДНҚ 
кесінділері ғана кӛрінеді, ал олардың гельдің басынан жылжыған ара 
қашықтығы кесіндінің ұзындығына дәлме-дәл келеді. Енді ДНҚ тізбегін 
тӛменнен жоғары қарай оқып, геннің нуклеотидтік қатарын анықтауға 
болады. 
Зерттеуші екінші комплементарлы ДНҚ үзіндісінің нуклеотидтер 
қатарын анықтап, бірінші тізбектен алынған мәлімет дұрыстығын тексере 
алады. Мұнда тек, бірінші тізбектегі аденин мен цитозиннің орнына екінші 
тізбекте тимин мен гуаниннің сәйкес келетінін естен шығармау керек. 
ДНҚ тізбегінің нуклеотидтер қатарын анықтаудың Сэнгер әдісі. Сэнгер 
әдісінің шығу тарихы. ДНҚ-ның нуклеотидтер қатарын анықтаудың екінші 
тәсілін Нобель сыйлығының екі дүркін лауреаты атанған ағылшынның 
атақты ғалымы Ф.Сэнгер ұсынды.
Сэнгер әдісінің кӛп жақтары Максам-Гильберт әдісімен ұқсас 
болғанымен оның принципінің айырмашылығы бар — Сэнгер бойынша 
нуклеотидтер қатарын анықтау ДНҚ-полимераза, яғни ДНҚ-ны 

69 
ажырататын емес, керісінше оны синтездейтін фермент кӛмегімен іске 
асады. Мұнда ген үзіндісінің ӛзі емес, ДНҚ-полимеразаның кӛмегімен 
синтезделетін ДНҚ молекуласы зерттеледі. Ферменттің әсерімен ұзындығы 
әртүрлі ДНҚ молекулалары синтезделеді, олардың 5'-ұштары бірдей, ал 3'-
ұштары тӛрт азоттық негіздің (А, Т, Г немесе Ц) бірі бойынша әртүрлі. 
Сэнгер әдісінде нуклеотидтер қатары белгісіз ДНҚ сегментін М1З 
бактериофагының ДНҚ-сынан құрастырылған арнайы векторға енгізеді. 
Біз бұл фагтың векторлық молекула ретінде ыңғайлы айырмашылығын 
жоғарыда қарадық, атап айтқанда генді жалғыз тізбекті күйде тасымалдай 
алады. Мұндай тізбектің нуклеотидтер қатарын анықтау оңай. М1З 
бактериофагының ДНҚ-сы қос тізбекті күйде де бола алады. Осындай 
фагтың негізінде бірнеше векторлар құрастырылды. Фагтың репликациясы 
үшін оның геномының маңызды емес аймағына шамамен ондаған әртүрлі 
рестриктазалар үзе алатын полилинкер жалғанады. Полилинкердің 
қатарына 17 н.ж. құралған тізбек жалғанады. Осындай векторды 
рестриктазалардың бірімен үзгеннен кейін оны талдауға алынған және сол 
рестриктазамен үзілген ДНҚ бӛлігімен біріктіреді. Мұнда ол вектордың 17 
мүшелік тізбегімен қатар орналасады. Міне, осындай рекомбинантты ДНҚ-
ны бактерия жасушасына енгізіп, одан жалғыз тізбекті ДНҚ-сы бар 
фагтарды алады. Енді фагтан ДНҚ-ны айырып, оны талдауға кірісуге 
болады. 
«Тізбекті үзу» әдісінің маңызы. Сэнгер әдісі «тізбекті үзу» әдісі деп 
аталады. Яғни ДНҚ-полимераза арқылы түзілетін комплементарлы ДНҚ-
ның синтезі Максам-Гильберт әдісіне сәйкес әрбір негізде тоқтайды. 
(үзіледі). Ал, ДНҚ-полимераза үшін ашытқы (праймер) керек, ол үшін 
вектордың 17-мүшелік тізбегіне комплементарлы олигонуклеотид 
синтезделеді. 
Егер 
олигонуклеотид-ашытқыны 
матрицалық 
ДНҚ-мен 
байланыстырып, ДНҚ-полимераза мен дезоксинуклеозидтрифосфаттарды 
қосса, онда ДНҚ бӛлігінің толық кӛшірмесін ала аламыз. Мұнда әрбір 
келесі азоттық негіз ӛсіп жатқан тізбектің 3'-ұшының гидроксил тобына 
жалғанатынына мән беру керек. Сэнгер әдісі үшін ДНҚ бӛлігінің толық 
кӛшірмесі емес, оның үзінділері қажет. 
Матрица-ашытқы комплексін тӛрт бӛлікке бӛледі де, олардың 
әрқайсысына тізбектің 3'-ұштары азоттық негіздерінің аналогтары — 
дидезоксинуклеозидтрифосфаттарды 
(ddNТФ) 
қосады. 
Мұндай 
дидезоксинуклеозидтердің рибоза қалдығының кӛміртегі атомдарында 
гидроксил тобы болмайды, сондықтан ӛсіп жатқан 3'-ұшының синтезін 
белгілі негізден кейін тоқтайды. Мысалы, тимидинмен аяқталатын ДНҚ 
фрагменттерін алу үшін ортаға дидезокситимидинтрифосфатты, тізбекті 
аденозин бойынша үзу үшін дидезоксиаденозинтрифосфатты және т.с.с. 
қосады.

70 
Әрине, тӛрт бӛліктің әрқайсысына қалыпты дезоксинуклеозид-
трифосфаттардың бірін (dТТФ, dАТФ, (dЦТФ және dГТФ) қосу керек. 
Нәтижесінде ұзындығы әртүрлі, бірақ 3'-ұштары бірдей олиго- және 
полинуклеотидтер жиынтығын алады. Олардың электрофореграммасын 
радиоавтография әдісі арқылы оқып, геннің нуклеотидтер қатарын 
анықтайды. 
Максам-Гильберт және Сэнгер әдістерін қолданып, РНҚ тізбегінің 
нуклеотидтер қатарын да анықтауға болады. Бұл әдістердің осы заманғы 
молекулалық биология мен генетика үшін маңызы зор. Оларды пайдалану 
арқасында қазіргі кезде кӛптеген вирустар, бактериялар және олардың 
плазмидалық элементтері геномдарының алғашқы құрылымы анықталды. 
Нуклеотидтері белгілі гендердің ұзындығы 6 млн. асып кетті. Қазіргі кезде 
кейбір митохондрия мен хлоропластардың ДНҚ құрылымы толық белгілі 
болды, олардың ДНҚ молекуласының ұзындығы 150 н.ж. асып түсті. 
Осы заманғы генетикалық инженерияның жетістігін адам геномына 
инструменттік шабуыл басталуынан байқауға болады. Адам ДНҚ-сының 
нуклеотидтер қатарын анықтауды АҚШ ғалымдары тікелей қолға алуда. 
Адамның ДНҚ-сы 3 млрд. нуклеотидтерден құралған, сондықтан олардың 
орналасу қатарын анықтау кӛп қаражатты және кӛптеген ғылыми 
генетикалық зертханалардың бірігіп жұмыс істеуін керек ететін аса күрделі 
іс болып саналады. Кейбір ғалымдардың есебі бойынша 3-6 млрд. доллар 
(әр нуклеотидке 1-2 доллар) жұмсап, адам геномының проектісін 15-20 
жыл аралығында шешуге болады. Қазіргі кезде нуклеотидтерді анықтау 
жылдамдығын кӛбейтіп, жұмсалатын қаржыны азайту (әр нуклеотидке 50 
цент жұмсау) жолдары талқылануда. Мысалы, Сэнгер бойынша 
нуклеотидтер қатарын анықтаудың автоматты әдістері құрастырылды, 
мұндай жаңа автоматты приборлар адам геномының оқылуын жеңілдетеді 
деп күтілуде. 
Хромосома және геном деңгейіндегі генетикалық инженерия. 
Генетикалық 
инженерияның 
деңгейлері. 
Әдетте 
генетикалық 
инженерияның үш деңгейін ажыратады: 1) гендік-рекомбинантты ДНҚ-ны 
тікелей зерттеу; 2) хромосомалық-гендердің үлкен топтарын немесе бүкіл 
хромосомаларды манипуляциялайды; 3) геномдық — бір жасушаның 
генетикалық материалын басқа жасушаға тасымалдайды. Генетикалық 
инженерияның бірінші деңгейі рекомбинантты ДНҚ технологиясының әр 
алуан әдістерін біз жоғарыда толық талқыладық. Енді генетикалық 
инженерияның қалған деңгейлеріне қысқаша тоқталамыз. Қазіргі кезде 
хромосома деңгейіндегі генетикалық инженерияны хромосомалық 
инженерия деп атауға болады, ал геномдық инженерия ӛзінің мәні 
бойынша жасуша инженериясына сәйкес келеді. 
Хромосомалық инженерия. Хромосомалық инженерияны эукариоттық 
ағзаларда қарастыруға болады, ӛйткені прокариоттарда «хромосома» және 

71 
«геном» түсініктемелері біртекті қаралады. Жалпы хромосомаларды және 
олардың фрагменттерін биологиялық объектілерді ӛзгерту әдісі ретінде 
тасымалдау, әсіресе, болмашы рӛл атқарады. Дегенмен, мұндай әдістің 
іргелі мағынасы зор және болашақта елеулі рӛл атқаруы мүмкін. 
Хромосомаларды басқа жасушаға (реципиенттік) трансформациялау үшін 
алдымен оларды жасушадан (донорлық) бӛліп алу қажет. Ол үшін жасуша 
бӛлінуін колхициннің кӛмегімен метафаза сатысында тоқтатады. Одан соң 
жасушаларды 
гипотонустайды. 
Хромосомалардың 
таза 
бӛлігін 
дифференциалды центрифугалау арқылы бӛледі. Қазіргі кезде хромосома 
немесе оның бӛліктері реципиенттік жасушаға пиноцитоз жолымен енеді. 
Жасушаға енген инактілі хромосомалар ӛздерінің кұрылымын бірнеше 
ұрпақ деңгейінде сақтап тіпті репликациялана алады. Нәтижесінде мұндай 
хромосомалардың гендері полипептид синтезін іске асыра алады. Жалпы 
жасушаға енген хромосомалар ақырында лизосомалық ферменттер 
әсерінен жеке бӛліктерге ыдырайды. Хромосомалық инженерияның 
әдістері жануарлар хромосомаларының генетикалық картасын құрастыруға 
үлкен мүмкіндіктер береді. 

жүктеу/скачать 1,31 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: