Б. Б. Ерниязова
ДНҚ векторлық молекулалары
жүктеу/скачать 1,31 Mb. Pdf көрінісі
|
ГЕНДІК ИНЖЕНЕРИЯ
|
6.3 ДНҚ векторлық молекулалары Қарастырылған әдістер in vitro жағдайында кез келген ДНҚ фрагменттерін рекомбинациялауға мүмкіндік береді. Гибридті молекулалар құрамындағы фрагменттердің бірінде белгілі бір жасуша түрінде автономды репликациялауға қажетті ақпараты болса, онда ол фрагментпен ковалентті байланысқан басқа ДНҚ фрагменттері жасушаларда кӛбеюге, яғни амплификацияға мүмкіндік алады. Жалғыз жасушадан ӛсірілген таза колониялық ӛсінді бӛліп алғанда сол жасуша құрамындағы жекелеген гибридті ДНҚ молекуласының клондануы жүреді. Молекулалық клондану кезінде донорлық және векторлық ДНҚ-лар белгілері нақты сайттардан үзілуі қажет. Егерде хромосомалық ДНҚ-ны диаметрі ӛте кішкене инесі бар шприц арқылы ӛткізетін болсақ немесе ультрадыбыспен әсер етсек, онда ұзындығы әртүрлі фрагменттер жиынтығы алынады. Донор ағзадан қажетті гендерді бӛліп алады, яғни нативті ДНҚ-ны экстракциялайды. Ары қарай оны ферменттік гидролиздейді және қайтадан вектор ДНҚ-мен қосады. Ол үшін лигазалар қажет. Сонда алынатын конструкция клондаушы вектор енгізілетін ДНҚ. Осы конструкцияны жасуша иесіне (реципиентке) енгізеді. Ол жерде репликация жүреді, жасуша бӛлінеді, нәтижесінде генетикалық материал жаңадан түзілген жасушаға беріледі. Белгілі концентрациялы бактериялық суспензияны қатты ет-пептондық қоректік ортаға, мысалы, қосымша қоректік заттар бар агарға егеді, сонда Петри шыны ыдысының 1 см 2 бетіне 1-10 бактериялар келуі керек. Агардың үстіне түскен бактериялық жасушалар бӛліне бастайды, соңында олардың әрқайсысының кӛптеген ұрпақтары сыртқы пішіні бойынша саңырауқұлақтың қалпақшасына ұқсас кішігірім шоғырлар түзеді. Әр шоғырда бастапқы бір бактериялық жасушадан түзілген және одан ешқандай айнымайтын кӛптеген жасушалар бар, оны клон деп атайды. Бастапқы суспензияның әрбір жасушасы да ӛз клонын түзеді (позитивтік колония). 56 Вектор ретінде бактериофагты қолданғанда генді бактерияға енгізу және соңғыны қоректік ортада ӛсіру жоғарыдағыдай плазмидалық вектор қолданғандағыдай ӛтеді. Фаг ДНҚ-сы (енбеген жасушалар) агарда кӛбейіп, кӛмескі тегіс «газон» түзеді. Ал, фаг ДНҚ-сы бар бактериялар түскен орындарда мӛлдір дӛңгелек ойыстар түзіледі, оларды негативтік шоғыр деп атайды. Негативтік шоғырдың түзілуі жасушада фаг ДНҚ-ның репликациялануына және жетілген фагтардың пайда болуына байланысты. Бұдан кейін фагтар басқа жасушаларға еніп, оларды ыдыратады, нәтижесінде әрбір ойыс бір ғана ДНҚ-сы жасушаға енген ДНҚ-ның копиясы бар фаг ұрпақтарынан тұрады. М13 фагы жасушаны лизиске әкелмегендіктен негативтік шоғыр түзбейді. Бірақ олар кӛбейген орындарда бактериялық жасушаның бӛлінуі бәсеңдейді, сондықтан жалпы кӛмескі газонда мӛлдірлеу ойыстар пайда болады. Соңғы газонда қажет рекДНҚ молекулалары енген бактериофагтардың кӛбеюі ӛтеді. жүктеу/скачать 1,31 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|