Б. Б. Ерниязова
Рестриктаза-лигазалық әдіс
жүктеу/скачать 1,31 Mb. Pdf көрінісі
|
ГЕНДІК ИНЖЕНЕРИЯ
|
6.2 Рестриктаза-лигазалық әдіс In vitro жағдайында гибридті ДНҚ молекулаларын алудың ең қарапайым немесе кең таралған әдісі. Бұл әдіспен ең алғаш рет гибридті ДНҚ молекуласын алған. Оны 1973 жылы С.Коэн ашты. 1. 1 типтегі рестриктазалардың кӛмегімен ДНҚ молекуласын таңдамалы түрде фрагменттерге үзеді. Олардың ӛзара комплементарлы сәйкес келетін «жабысқақ» ұштары болады. 2. Бір рестриктазаның кӛмегімен әртүрлі ДНҚ молекулаларын үзіп араластырады. Белгілі бір жағдайда жабысқыш ұштары комплементарлы байланыс түзіп бірігеді. 3. ДНҚ лигаза кӛмегімен және фрагменттер бір – бірімен біріктіріледі (23- сурет). Әрбір лигазалық реакциядан кейін гибридті ДНҚ молекулаларының түрлі қоспасы түзіледі. Олардың ішінен қажетті құрылымдағы мақсаттық молекулаларды іріктеп алады. Ары қарай жасушаға енгізу сатысы және гибридтерді кӛбейту сатысы жүреді. Бұл кезде лигазалық реакциядан кейін аздаған бӛлікті ғана іріктеуге болады. 23-сурет - Рестриктаза – лигазалық әдіс сызбасы Бұл әдісте in vitro жағдайда екі немесе одан да кӛп фрагменттерді біріктіруге болады. Бірақ бір ғана рестриктаза болғандықтан зерттеуде ДНҚ-ның жиынтықтағы фрагменттері алынады. Сондықтан бұл әдіс 54 шектеулі болады. Кейін оның жаңа модификациясы жасалды. Рестриктазалар танитын бірізділіктері бар жасанды ДНҚ сегменттері линкерлік молекулалар қолданыла бастады. Бұл әдісті 1977 жылы Р.Шеллер ӛз әріптестерімен бірге ұсынды. Бұл ӛзгертілген әдістен іс жүзінде, in vitro жағдайда кез келген ДНҚ фрагменттерін рекомбинациялауға болады. Келесідей сатылардан тұрады: 1. Рекомбинацияланған ДНҚ фрагменттерінің «доғал» немесе «жабысқақ» ұштарына Т4 фагының лигазасы арқылы қысқа жасанды екі тізбекті сегменттерді жалғайды. Бұл сегменттерде белгілі рестриктаза танитын сайттар болады. 2. Алынған фрагментті арнайы рестриктазамен ӛңдейді, нәтижесінде «жабысқақ» ұштары бар фрагменттер алынады. 3. Алынған фрагменттерді басқа ДНҚ молекулаларымен рекомбинацияланған гибридті молекулалар жасайды. Рекомбинантты ДНҚ құрастырудың қаралған үш әдісінің бірнеше модификациялары (ӛзгешеліктері) бар және де ген мен векторлық молекуланың ерекшелігіне байланысты әдіснамасы әртүрлі болуы мүмкін. Кейде ДНҚ фрагментіне де, вектордың ұшына да жасанды қос тізбек (линкер) жалғайды (24-сурет). 24-сурет - Линкерлік молекуланы пайдаланып рекДНҚ құрастыру сызбасы Сонан соң линкерді танитын және оны «жабысқақ» ететін рестриктазамен үзеді. Осылайша бұл жолмен де «жабысқақ» ұштар 55 алынады. Рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастырудың бұл әдісі Лобан-Берг идеясына сүйенеді. Кӛпшілік жағдайда линкер технологиясы қолданылады. Әрбір лигазалық реакциядан кейін гибридті ДНҚ молекулаларының түрлі қоспасы түзіледі. Олардың ішінен қажетті құрылымдағы мақсаттық молекулаларды іріктеп алады. Әрі қарай жасушаға енгізу сатысы және гибридтерде кӛбею сатысы жүреді. Бұл кезде лигазалық реакциялардан кейін аздаған бӛлікті ғана іріктеуге болады. жүктеу/скачать 1,31 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|