Гибридті жасушаларды алу кезеңдері

1. 
   Мембрананың ауыспалы электрлі немесе магнитті өріспен деполяризациялануы, жасушалардың қосылуына - катиондардың көмегімен мембрананың теріс зарядының бейтараптандырылуы әсер етеді.
   
2. 
   Қосылып кетудің алдында өсімдік, саңырауқұлақ және бактериялық жасушалар жасуша қабырғасынан босатылады, соның салдарынан протопласттар пайда болады.
   
3. 
   Лизоцим (бактериялық жасушаларға арналған), ұлудың зимолиазасын (саңырауқұлақ жасушаларына), саңырауқұлақтардан шығарылатын целлюлазалар кешенін, гемицеллюлаза және пектиназаны (өсімдік жасшаларына арналған) қолдана отырып жасуша қабырғасын ферментативті гидролизге ұшыратады.
   
4. 
   Протоплатардың ісіну және бұзылуын ортаның осмостығын ұлғайту арқылы алдын алады.
   
5. 
   Алынған гибридті жасушалардың скринингі үшін әртүрлі әдістер қолданылады: 1) фенотиптік белгілерді есепке алу; 2) тек ата-аналарының жасушаларының геномы қосылған гибридтер ғана тіршілігін сақтайтын таңдаулы шарттар жасау.
   

1. Жекеленген пішін түрлерін филогенитикалық шағылыстыру мүмкіндігі.

2. Бір ата-анадан толық гендер жиынын, ал екінші ата-анадан дербес жиынды тасушы ассиметриялық гибридтерді алу. Мұндай гендер организмдер жасушалары қосылған кезде жиі кездеседі.Ассиметриялық гибридтер гендерді толық тасушы симметриялық гибридтерге қарағанда орнықтырақ, жемістірек және өмірсүргіш келеді.

3. Үш немесе одан да көп ата-аналық жасушаларды қосу арқылы гибридтерді алу. Осындай гибридті жасушалардан регенерантты өсімдіктерді (саңырауқұлақтар) өсіру мүмкіндігі бар.

4. Әртүрлі даму программасын тасушы жасушаларды гиридизациялау. Яғни - әртүрлі ұлпалар немесе органдар жасушаларының қосылуы, қалыпты жасушалардың жасушалармен қосылуы - яғни қатерлі өзгеру нәтижесінде даму программасы өзгергентүрлер.Осыдан гибридомды жасушалар немесе гибридомалар пайда болады,олар қалыпты ата-ана жасушасынан әртүрлі пайдалы қосылысты синтезге кабілетін алады, ал қатерліден - тез әрі тоқтамсыз өсуді алады.
Гибридомді технология. Қазіргі уақытта клеткалы инженерияның негізгі бағыты - гибридомды алу болып табылады. Негізгі мақсат - қатерлі ісік жасушасы мен алынған гибридомды жасушы сызығының қосылып бағалы заттар шығаратын жасушаның тіршілігін мәңгілік ету. Гибридомді технология көп жағдайда жануар жасушасына қолданыдады, оның көмегімен гормондар және қанның ақуызды факторларының шектеусіз көбеетін продуценттерін алуды жоспарлайды. Иммундық жүйенің қатерлі ісік клеткалары (миолема) мен сол жүйенің қаліпті жасушалары - лимфоциттер қосылуынан пайда болған өнім - өте үлкен практикалық мағынасы бар гибридомалар болып табылады.

Адам немесе жануар организміне бөгде зат - бактерия, вирус, «бөгде» жасуша немесе күрделі органикалық қосылыс түскенде - лимфоциттер түскен бөгде затты залалсыздандыру үшін күш жұмылдырады. Атқаратын қызметтеріне қарай лимфоциттердің бірнеше популяциясын ажыратады.

Т-лимфоциттер, олардың ішінде ағзаға енген бөгде затқа шабуылдап белсенділігін төмендететін Т-киллерлер ерекшеленді, және В-лимфоциттер, басты мақсаты иммунды ақуыз (иммуноглобулин) өндіру, олар бөгде затты беткі қабатымен байланыстыру арқылы залалсыздандырады, басқаша айтқанда В-лимфоциттер бөгде затқа антидене болып табылатын иммундық ақуыз бөліп шығарады.

Т-лимфоцит-киллер мен ісік жасушасы қосылып тоқтамсыз көбейетін жасушалар клонын береді. Осындай Т-киллер гибридом клондарын науқас оганизміндегі қатерлі ісік жасушаларымен күресу үшін қолдану жоспарланып отыр.

В-лимфоцит пен миолем жасушасы қосылуының нәтижесінде В-гибридомді клондар пайда болады. Олар антидене продуценті ретінде кең қолданыс тапқан, антидене сияқты антигенге көзделген, В-лимфоциттен пайда болған клондармен синтезделетін - яғни моноклинальді антидене.

Моноклинальді антиденелер қасиеттері бойынша біртекті,олар біркелкі уәкілге бірдей туысқандыққа ие болады және жалғыз-ақ қарсы гендік детерминанттармен жалғастырылады.

Адамның иммундық жасушалары негізінде буданды алудың технологиясын игеру түбегейлі қиындықтармен байланысты:адамның гибридомалары баяу өседі, салыстырмалы түрде тұрақсыз. Кемшіліктері:олар кептірілген күйде тұрақсыз және кәдімгі антиденелердің қоспасында сақтаудың таңдамалы шарттарында орнықты келетін антиденелер кездеседі.

Миелом жасушалары мен иммундық лимфоциттер неізінде будандарды алудың жалпы үлгісі келесі кезеңдерден тұрады.

1. Гибридомды жасушалардың келесі селекциясы барысында тіршілігін жоятын мутантты ісік жасушаларын алу.

2. Лимфоциттерді алу - берілген антигенге антидене продуцентін алу. Жануарды (тышқан, сирек егеуқұйрықты, қоян) құрсақ қуысына, көктамырішілік немесе тері астына енгізумен иммунитеттейді. Адамның гиридомаларын алу күрделі және көп сатылы күрделі процедура табылтын ұлпа культурасында адамның лимфоциттерін иммунитеттейді.

3. Лимфоциттердің ісік жасушаларымен қосылуы:қосушы агент болып полиэтиленгликоль, сирек түрде лизолецитин немесе Сендай вирусы, және де қуаттылығы жоғары электр өрісі қолданылады.

4. Гибридомды жасушалар скринингі. Нуклеотидтер синтезінің маңызды жолдарын жауып тастайтын аминоптериннен тұратын селекциялық орта НАТ қолданылады, және биосинтездің қосымша жолдарының алғызаттары болып табылатын гипоксантин мен тимидин де қолданылады. Бұл ортада ата-аналық миелом жасушалары биосинтездің қосыша жолдар ферменттері бойымен генетикалық ақаулы сияқты тіршілігін жояды. Миелом жасушаларымен қосылмаған ата-аналық лимфоциттер де тіршілігін жояды, себебі олар организм сыртында өмір сүре алмайды. Гибридомды жасушалар шексіз өсуге және қосымша жолдар бойынша нуклеотидтер синтезіне бейім, сондықтан олар культурада жинақталады.

5. Гибридомды жасушалардың берілген антигенге моноклональді антидене шығару қабілетін тексеру. Ол үшін иммуносорбенттер әдісі қолданылады. Гибридомды жасушалары бар сұйықтық үлгісін сақтаушыда нық бекітілген антигені бар реакцияға енгізеді. Антиген - антидене кешенін айырып тану үшін - пайдаланылатын антиденеге жануардың осы иммуноглобулиндерін иммундау арқылы екінші антиднелерді алады (мысалы, тышқаның иммуноглобулиндерін ешкінің организміне енгізеді). Бұл екінші антиденелер ковалентті түрде қандай да бір ферментпен байланысады (мысалы, сілтілік фосфатазмен немесе пероксидазамен). Егер гибридомадан өндірілген антидене шынында берілген антигенді байланыстырса, онда оған екінші ферментпен қосылған антеденені қоссақ ол мынандай кешен пайда болуына жағдай жасайды - антиген-моноклональді антидене - антидене моноклональді антиденеге - фермент.

6. Моноклональді антидене өндіруіне байланысты тексеруден өткен және иммундық жүйесінің тұрақтылығына байланысты күнделікті бақылаудын өткен гибридомды жасушаларды клондау.

7. Гибридомаларды жаппай өсіру,шығару және шығарылатын антиденеледі қойылту және тазарту.

Өсімдіктер түрлері мен микроорганизмдер штаммаларының жаңа түрлерін шығару және бар сұрыптарын мейлінше жақсарту.

Жасушалық инженерияның маңызды және песпективалы бағыты -өсімдік түрлері мен микроорганизмдер штаммаларының жаңа түрлерін шығару және бар түрлерін жақсарту. Бірақта протопластардың қосылуы негізінде өсімдіктердің жаңа үрін шығару үшін екі негізгі кедергіден өту керек: а) протопластардың жасушалық қабырғамен қапталған жасушаға айналуы; б)жасушадан тұтас өсімдік алу. Бұл екі негізгі қосымша кедергіден басқа қосымша қиыншылықтар бар. Тұтас дарақтың регенерацияға мүмкіншілігі көрсетіліп, екі ата-аналық протопластта өсімдіктер түріне жатса да қосылған жасушалар осындай регенерацияға қабілетін жиі жоғалтып алады.

Биореактор, культивирленген микроорганизмдер немесе өсімдіктер мен жануарлар клеткаларының үлкен популяциясымен қамтылған. Бұл популяцияда 10¹⁰ және одан аса жасушалар бар, олар өз кезегінде жер бетіндегілерден миллион есе асады. Бұл жағдайларда екіталай генетикалық мәселеге негізделген процестер үлкен рөл атқарады. Сонымен төменгі жиілікті спонтанды мутациялар (1 мутация 10⁶-10⁸жасушаға) биореакторда мутантты түрлердің тез жиналып қалуына әкеледі. Әсіресе мынадай жағдайда егер де осындай түрлер тез өсу жылдамдығымен сипатталса. Жасушалық популяцияда бейімделген жасушалар азырақ бейімделгендерді шығарып тастауы автоселекция деп аталады, яғни бұл көбінесе селекционердің қатысуынсыз және оның жоспарынан тыс болатын процесс. Бактерияларда 3 форманың (K,S,M) жиі өзара өтуімен сипатталатын фазалық диссоциация көрсеткіштік үлгі болып қызмет етеді. Бұл формалар жасушалық қабырға мен капсуланың құрылысымен өзгешеленеді. Сонымен қатар көптеген физиолого-биохимиялық қасиеттерімен, оның ішінде биологиялық активті заттар синтезіне қабілеттілік те бар.

Жануарлар және өсімдіктер жасушаларын ағзадан тыс культивирлегенде ұқсас мәселелер пайда болады. Жасуша белгілерінің культивирлеу процесі кезінде өзгеруі оның көпклеткалы организмнен қоректік ортасы бар ыдысқа ауыстырған кезде пайда болған қауырт өзгеріспен байланысты.

Үлкен жасушалық популяцияда өтетін мутанттау мен селекцияның спонтанды процестерінің жақсы жақтары болуы мүмкін:

1. 
   Мақсаты биомасса алу болып табылатын өндірістік процестерде автоселекция продуктивті және көп бейімделгіш формалар басымдығына әкеледі.
   
2. 
   Егер зерттеуші келесі селекционды жұмысқа бастапқы формадан өзгешеленетін формалар алуға тырысса, бұл процестерде биотехнологиялық маңызды қасиеттер жоғалса, онда бұл жаман жағы болады. Әдетте генетикалық және жасушалық инженерия негізінде алынатын штаммдар тұрақсыз болып келеді.
   

Микроорганиздер культураларының халықтық әдістері олардың жиі ауыстырылатын бай қоректік ортада өсірілуіне әкелді. Осы кезде пайда болатын мутанттар мен автоселекцияға жағымды жағдайлар көбінесе штамм-продуценттердің жоғалуына әкеп соқтырады. Басқа әдістер пайда болмағанша бұл әдіс қана қол жетімді. Популяцияда қажет емес мутанттардың жиналуының алдын-алуға болады, егер де әр қайта отырғызудан соң жасушалар клондарының функционалды активтілігін тексеретін скрининг өткізсе.

Гибридпен клондау кезінде жасушаның маңызды қасиеттерін сақтау үшін қандай жолдар қарастырылған?

Жасушаларды ұзақ уақыт бойы маңызды қасиеттерін жоғалтпай сақтауға болады, егер де онда болып жатқан барлық өмірлік процестерді тоқтатса,оның ішінде генетикалық қайта құрылуды да. Бұл кезде культура – анабиоз сияқты жағдайға түседі және сақтау әдістері анабиозға жақындау сатысы бойынша жіктеледі:

1. 
   Жасушаның лиофильді кептірілуі (вакуумда мұздатылғаннан кейін 60ºС және одан төмен температурада обезвоживание). Бұл әдіс –жақсы, мысалы, белсенділігін бірнеше жылға сақтайтын антибиотиктер үшін. Дегенмен бионысаналардың барлығы лиофилизациядан өте алмайды. Лиофилизация жағдайында өміршеңдігі төмен жасушалар өледі де, популяция өмір сүруге қабілеті мол жасушамен толықтанады.
   

2. 
   Стерильді топырақ ауасында, құмда, белсендендірілген көмірде, кейбір өсімдіктердің ұрықтарында, агар-агар дисктерінде, қағазда, жүнді жіпшелерде және өзге тасымалдаушыларда кептіру. Бұл әдіс салыстырмалы түрде қарапайым. Бірақ ол популяцияда болып жататын гентикалық өзгерістерді жеткіліксіз деңгейде тоқтатады. Соңғы жылдары сұйық жағдайдағы вакуум астында кептіру қолданылады. Микроорганизмнің кей түрлері, әсіресе, лиофилизацияны өте алмайтындар осындай өңдеуден кейін өмірге қабілетті жағдайда сақталады. Ал бионысананың көпшілігі кептіруді көтере алмай, өледі.
   
3. 
   Споралар сақталуы (спора түзетін бактерияларға жарамды).
   
4. 
   Криоконсервация –жасушалардың терең мұздатылуы және сонан соң сұйық азотта (-19º) немесе оның буында (-150º) кептірілуі. Басқа сақтау әдістерінде сақтала алмайтын - цианобактериялар, пурпурлы және жасыл бактериялар, мицелиальді саңырауқұлақтар, актиномицеттер, қарапайымдылар, балдырдар, өсімдік және жануар жасушаларының культуралары, гибридомдар, гендік-инженерлік мутанттарды осы жолмен ұзақ уақыт бойы сақтауға болады. Терең мұздатылған жағдайдағы организмдер жинақтамасы – крио-банкалар жасалынды. Криоконсервация толықтай жасуша популяциясының гендік фондының бұзылуына кедергі болады.
   
5. 
   Комбинирленген сақтау әдістері. Кейбір жағдайларда маңызды қасиеттердің жақсы сақталуы бірнеше сақтау әдістерінің комбинациясы арқылы жүзеге асады. Яғни, жасушалардың біртіндеп кептірілуі, келесі лиофилизацияда немесе төменгі температурада сақталуында, олардың өміршеңдігі мен биохимиялық белсенділігін сақтауға септігін тигізеді.
   

Биотехнология ғылым ретінде техникада және өнеркәсіп өндірісінде биологиялық үрдістерді пайдалану үшін қолданылады. Бұл үдерістер- мамандардың тізбекті әрекеттерінің құрамы ретінде биообъектілерді эксплуатациялаумен тиісті нәтижелердің жетістіктеріне бағытталған. Биотехнологиялық үдерістерді шартты түрде биологиялық, биохимиялық және биоаналикалық деп бөлуге болады. Біріншіге аккариот, прокариот және эукариотты пайдалануға негізделетіндерді жатқызады, екіншісі-ферменттерді пайдалануға, үшінші (биоаналикалық) – химиялық синтезде немесе заттардың жартылай синтезінде, қызметі ұқсас немесе тірі ағзалардың эквивалентті бірінші немесе екінші метаболиттері (пенциллин және цефалоспорин, тетрациклин, нуклеинді негіздерді және т.б. өнімдерін алу).