Жумина Асем Галымовна Тулегенова Сымбат Ержанқызы «Жасушалық биотехнология» пәні бойынша
жүктеу/скачать 4,2 Mb.
|
multi-213 x606468403
- Бұл бет үшін навигация:
- 2. Ағынды цитометрияны қолдану салалары
| 1. Ағынды цитометрия әдісі
Ағынды цитометрия – суспензиядағы бөлшектердің (мысалы, жасушалар) кейбір оптикалық параметрлерін бағалауға мүмкіндік беретін заманауй әдіс. Оптикалық параметрлер ретінде: оптикалық тығыздық, флуоресценция және жарықтың таралуы. Параметрлер қысқа уақытта анықталады, бұл жағдай жасушалардың үлкен массивын анықтауға мүмкіндік береді. Одан басқа, детекторға жасушалық сортер деген құрылғыны қосуға болады. Сортер жасушаларды жоғарыда берілген көрсеткіштер бойынша сұрыптауға мүмкіндік береді. Ағынды цитометрия арқылы жасушаларды талдаудың бір қатар ерекшіліктері болады: 1. Жасушаларды шыныда бояумен салыстырғанда жасушаларды бояудың ерекше әдісі. 2. Флуоресценциялаушы зондтар жасушалар үшін арнайы болу керек және ортаға шайылмау керек. 3. Флуорохромдар жасушалар өсірінділері үшін уытты болмау керек. 4. Флуорохромдар лазердің берілген бір түрінен қозу керек. Төменде цитофлуориметрдің сызбасы келтірілген. (1 сурет). Сурет 1. Цитофлуориметр және оның сызбасы Ағынды цитофлуориметрде жасушалар мөлшерін өлшеу әдістерінің бірі Культер принципіне негізделген. Культер принципі электролиттер ерітіндісінде жасушалар арқылы индукцияланған тізбектің электрлік кедергісін өлшеуіне негізделген. Алынған сигнал цифрлік өңдеуден өтеді. Жасуша ағынды ұяшықтың апертурасынан өткен кезде жасуша көлеміне тең электролит көлемі шығарылады. Биіктігі бойынша жасуша көлеміне тура пропорционалды кернеу импульсы пайда болады. Осы әдіс жасушалардың шағын өзгерістерін анықтауға мүмкіндік береді, яғни талдаудың дәлділігін қамтамассыз етеді. 2. Ағынды цитометрияны қолдану салалары Ағынды цитометрияны қолдану салалары алуан болып келеді: 1. Жасушалардың тіршілігін сақтау қабілетін талдау. Пропидии йодиді (PI) және 7-аминоактиномицин D (7-AAD) сияқты жасушаға енетін бояғыштарды тірі және өлі жасушаларды дифференциациялау үшін қолданылады. Өлі жасушалардың цитоплазмалық жарғақшасы өткізгішке айналады, соның нәтижесінде жасушалар боялады. Сонымен қоса тірі және өлі жасушалар көлемдерінде өлшеуге болатын айырмашылықтар бар. Өлі жасушаларды екі параметрді (көлемі мен жарықтың таралуын) тіркеу арқылы анықтауға болады. 2. Апоптоз саласындағы зерттеулер. Аннексин V-FITC мен 7-AADмен бояу арқылы апоптоздың әртүрлі кезеңдеріндегі жасушаларды талдауға болады. Сау жасушалардың цитоплазмалық жарғақшаның ішкі бетіндегі фосфатидилсерин қалдықтары апоптоздың ерте кезеңдерінде жарғақшаның сыртқы бетіне ауысады. Аннексин V-FITC фосфатидилсериннің экспонирленген молекулаларымен байланысады. 7-AAD зақымдалған плазмалық жарғақшамен жасушаларды бояйды. Апоптоздың ерте кезеңдерінде жасушалар Аннексин V-FITCпен байланысады, бірақ 7-AADмен әректтеспейді. Өлі жасушалар мен апоптоздың кеш кезеңдеріндегі жасушалар екі бояғышпен боялады. 3. Тіршілік циклдің әртүрлі кезеңдерінде жасушаларды талдау. Сол үшін ДНҚны DAPI немесе Hoechst сияқты бояғыштармен бояйды. Құрылғы жасушалар флуоресценциясын G0/G1, S және G2/M кезеңдерінде анықтайды және алынған нәтижелерді жасушалар мөлшері бойынша алынған мәліметтермен салыстыруға мүмкіндік береді. 4. Жасушалардың диаметрі мен көлемін әлемдік стандарттарға сәйкес өлшеу. Сол үшін калибровкаға арналған бөлшектер қолданылады. 5. Бактериялар саны мен тіршілікке қабілетін санау мен анықтау. Тірі және өлі бактерияларды Syto9 және PI бояғыштарымен бояйды. Syto9 (енетін бояғыш) барлық жасушалардың ДНҚсымен байланысады. PI тек зақымдалған және жарғақшаның функциялары бұзылған жасушаларды бояйды. Өлі және тірі жасушалардың концентрациясы мен үлесі жоғары дәлділікпен есептелінеді. 6. Жасушалар пролиферациясын зерттеу. Карбоксифлуоресцеиннің күрделі сукцинимидилді эфирдің диацетаты (CFSE) жасушаішілік аминдермен ковалентті байланысып, жасушалар эстеразалары әсерінен ыдырап, флуоресценциялауды бастайтын енуші бояғыш болып келеді. Жасушалар бөлінгеннен кейін жаңа түзілген жасушаларда бояғыштың концентрациясы төменірек болады. CFSEмен боялған жасушаларды өсіріндіде бірнеше күн өсіруге болады. Флуоресценцияның әр ұшы (пик) бөлінудің жаңа цикліне сай болып келеді. Оның ауданы циклдағы жасушалар санына сәйкес болады. жүктеу/скачать 4,2 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|