Клондық микропроцессордың әртүрлі кезеңдеріндегі өсімдік тіндерін өсіру кезеңдері мен әдістері

Клондық микропропагация кезеңдері:

- қолайлы экспланттарды іріктеу, оларды стерильдеу және қоректік ортаға көшіру;

- микропроцессордың өзі;

- өскіндердің тамырлануы, содан кейін оларды топырақ жағдайларына бейімдеу;

- жылыжай жағдайында өсімдіктерді өсіру және оларды далаға отырғызуға дайындау[6].

I кезең. Түсіндіруді таңдағанда, қолданылатын өсімдік түрін де, микро көбейту әдісін де ескеру қажет. Микроклондарды алу процесіне жыл мезгілі және ата-аналық өсімдіктің даму кезеңі әсер етеді, эксплант реакциясы көбінесе өсімдіктің қай мүшесінен алынғанына байланысты. Көптеген өсімдіктер белсенді өсу кезеңінде мәдениетке жақсы енсе де, кейбір өсімдіктердің экспланттары тек ұйқысыз фазада қашу түзеді. Лалагүл шамдарының таразыларының экспланттарынан жазда немесе қыста емес, көктемде немесе күзде қабылданса, балалардың қалпына келуін алу оңай. Наурыз айында оқшауланған апикальды карнавация меристемасы өміршең өсімдіктердің ең көп пайызын береді. Өсімдіктердің абсолютті жасы неғұрлым аз болса, қашу соғұрлым қарқынды өседі. Бұл тәуелділік әсіресе ағаш өсімдіктерінде айқын көрінеді.

Эксплантты оқшаулау және оны зарарсыздандыру туралы айтатын болсақ, стерилизацияның сәттілігіне әсер ететін экспланттың ата – аналық донор өсімдіктерін арнайы даярлау мәселесін елемеуге болмайды. Рудбекия розеткалық өсімдігінің стерильді мәдениетін алу үшін оны сабақты созу үшін қысқа күннен бірнеше күнге ұзақ күннің жағдайына ауыстырған жөн. Бұл өсімдіктердің сабақтарының бөліктерінде бүкіл жер үстінде жапырақтардың розеткасының пайда болуына әкеледі. Бұл жағдайда әдеттегі стерилизациялық ерітінділерді қолдану жақсы нәтиже береді[6].

Гербера-Розетка өсімдігі, оның қысқартылған сабағы апекспен бірге жерге батырылады. Сонымен қатар, қашудың жоғарғы жағы көптеген түктермен жабылған, олардың арасында жердің ұсақ бөлшектері жиналады. Мұның бәрі жалпы қабылданған шаралармен зарарсыздандыруды қиындатады. Тек аналық өсімдіктерді отырғызу әдісін өзгерту арқылы қанағаттанарлық нәтижелерге қол жеткізілді. Аналық өсімдіктерді сабақтың өсу нүктесі жерден жоғары болатындай етіп отырғызу керек. Деберг пен Мейн микро көбеюде арнайы нөлдік кезеңді бөлуді ұсынады, оның мақсаты өсімдіктерді экспланттарды оқшаулауға дайындау болуы керек. Нөлдік кезеңде өсімдіктерді төмен ылғалдылықпен және шектеулі суарумен жылыжайларда өсіру керек. Су топыраққа тікелей тамырға түсіп, арнайы капиллярлар арқылы енуі керек. Жоғарыдан суарудан аулақ болу керек. Бұл жағдайлар Өсімдіктердің өсуіне қолайлы емес, бірақ жұқтырған өсімдіктердің саны күрт төмендейді. Эксплантты оқшаулаудан бірнеше апта бұрын өсімдіктер пестицидтермен өңделеді, ал оның эксплант ретінде қызмет ететін бөлігі қоздырғыштардың жәндіктермен берілуіне жол бермеу үшін дәке сөмкесімен жабылады.

Қоректік ортаның химиялық құрамы, оның физикалық қасиеттері микропроцессордың әр кезеңінде қоршаған орта орындайтын міндеттерге сәйкес келуі керек. Бірінші кезеңде антиоксиданттар (цистеин, глутатион, аскорбин қышқылы) көбінесе қоректік ортаға енгізіледі, бұл гидролитикалық ферменттердің әсерін және отырғызылған экспланттардың өлімін болдырмайды. Мейер эксплантты оқшаулаудың барлық операцияларын аскорбин қышқылына малынған сүзгі қағазында жүргізуді ұсынады, ал экспланттарды дайындау кезінде және оларды трансплантациялау кезінде тіндерді құрамында антиоксиданттар бар ерітіндіге батырады. Белсендірілген көмірді қосу қашудың өсуіне пайдалы әсер етеді. Белсендірілген көмір эксплант шығаратын улы заттарды адсорбциялайды. Сонымен қатар, көмір ортадан және биологиялық белсенді заттардан адсорбцияланады, бұл бастапқы концентрацияны айтарлықтай төмендетеді. Сондықтан белсендірілген көмірі бар ортада фитохормондардың жоғары концентрациясын енгізу қажет. Микро көбеюдің бірінші кезеңінің маңыздылығы барлық кейінгі көбею процесі тіндердің немесе мүшелердің бастапқы мәдениетін алуға байланысты болатындығына байланысты. Бірінші кезеңде қоректік ортада минералды тұздардың, көмірсулардың, дәрумендердің, цитокининдердің және ауксиндердің, кейде гиббереллиндердің жоғары концентрациясы болады[6].

II кезең-көбеюдің өзі. Кейбір жағдайларда екінші кезеңдегі қоректік ортаның құрамы (көбеюдің өзі) өзгеріссіз қалады. Басқа жағдайларда ол in vitro морфогенетикалық реакцияларды тудыратын гормондармен байытылады. Көп жағдайда зерттеушілер Мурасиг пен Скуга ортасын қалайды. Экзогендік фитогормондардың көмегімен морфогенезді реттеу өсімдіктердің клональды микро көбеюінің негізі болып табылады. Ең көп қолданылатын цитокининдердің қатарына 0,5 мг/л дейінгі концентрациядағы кинетин, БАП, зеатин, ауксиндер – ИУК және НУК жатады. Қарақұмықтың аксиларлы бүршіктерін цитокининдердің әртүрлі концентрациясы бар ортада өсіру кезінде 0,5 – 1 мг/л концентрациясында BAP, сондай-ақ BAP (2,23 мг/л) + IUC (0,175 мг/л) пайдалану кезінде жақсы нәтиже алынды. Бір қызығы, 2,23 мг/л BAP және 0,175 мг/л IUCK бар ортада дамып келе жатқан қашу Розетка түрінде болды, олардың интеродтары созылмады, ал 0,5 мг/л BAP бар ортада аксиларлы қашу белсенділенуімен қатар олар тартылды. Бұл байламнан бір қашуды бөліп алуды және тамырлау кезінде оны трансплантациялауды жеңілдетті. Сонымен қатар, 0,5-1 мг/л BAP бар ортада таралған қашу тамырларды тезірек қалыптастырды[8].

BAP концентрациясының 1,5 мг/л-ге дейін жоғарылауы аксиларлы өсінділердің пайда болуын едәуір тежеді және кішкентай жағымсыз, нашар дамыған бүршіктердің пайда болуына әкелді. Концентрацияның 0,1 мг/л дейін төмендеуі аксиларлы өсінділердің дамуын тежеді және көптеген генеративті бүршіктердің пайда болуына және сабақтың түбінде тамырлардың пайда болуына себеп болды. Алайда, АІҚ ортасына төмен концентрацияда енгізу (2,23 мг/л ӘАК және 0,175 мг/л ИУК) ӘАБ жоғары концентрациясының ингибиторлық әсерін жеңілдетіп, аксиларлы өсінділердің шығуын арттыруға ықпал еткенін атап өткен жөн. Сонымен қатар, BAP төмен концентрациясын (0,1 – 0,5 мг/л) қолдану татар қарақұмығының тұқым себуден гөрі клондық микро көбеюі үшін тиімді болды. Люндерган мен Джаник бір жағынан 5 мг/л концентрациясындағы BAP алма ағашының жасуша мәдениетіндегі аксиларлы қашуының максималды дамуына себеп болғанын анықтады, бірақ екінші жағынан, бұл өсіп келе жатқан өсінділер пайда болуына әкелді. Сонымен қатар, BAP 1 мг/л концентрациясы кезінде бүйректен қалыпты қашу пайда болды, сонымен бірге микро көбею жылдамдығының аздап төмендеуі байқалды. Попов пен Высоцкийдің айтуы бойынша, құлпынай қашуын ұзақ уақыт өсіру кезінде, кейбір жағдайларда аксиларлы меристемалардың көбеюіне де, тамырдың пайда болуына да қабілетсіз пассивті бүршіктер пайда болды. Шамасы, олардың тіндерінде қашу өсіру процесінде фитохормондардың қажетті физиологиялық деңгейден біртіндеп жиналуы жүреді және сонымен бірге олардың уытты әсері байқалады. Цитокининдердің теріс әсерін тұрақты қамтамасыз ететін цитокининдердің минималды концентрациясы бар қоректік ортаны қолдану арқылы жеңуге болады көбею коэффициенті немесе цитокининдердің төмен және жоғары деңгейі бар ортада ауыспалы өсіру циклдері.

III-IV кезеңдер-микро жүгірістердің тамырлануы, олардың топырақ жағдайларына бейімделуі және далаға отырғызылуы. Бұл ең көп уақытты қажет ететін кезеңдер, бұл клондық микропроцессордың сәттілігіне байланысты. Жерге тамырлау және отырғызу кезеңінде қоршаған ортаның негізгі құрамы әдетте өзгереді. Азайтады тұздарды және көмірсуларды, жоққа цитокинины қосады ауксины. Қашудың қалыпты тамырлануы үшін қажет ауксиндердің концентрациясын таңдау бірқатар себептерге байланысты. Олардың ішінде біз ата-аналық өсімдіктердің түрлері мен сорттық сипаттамаларына, қолданылатын ауксиннің түріне, сондай-ақ қашу өсіру сатысында фитохормондардың концентрациясы мен қатынасына байланысты қашудың тамырлануына тұқым қуалайтын бейімділігін атаймыз. Өскіндердің тамырлануы кезіндегі ауксиндердің тиімділігі микро көбеюдің бірінші және екінші кезеңдерінде қоректік ортаға енгізілген цитокининдердің жоғары дозаларының әсерінен айтарлықтай төмендейді. Алғашқы кезеңдерде өсіру кезінде алдымен цитокининдердің жоғары, содан кейін төмен концентрациясы бар ортаны қолданған жөн[7].

Кейбір жағдайларда тамырдың пайда болуы хлороген немесе ферул қышқылдарының қосылуымен ынталандырылады. Сондай – ақ, пробиркалардан алынған қашудың базальды бөлігін ауксин түріндегі стимуляторлардың ерітінділерімен 3-6 сағат жоғары концентрацияда емдеуді, содан кейін оларды гормоналды емес агаризацияланған ортада немесе қолайлы субстратта ex vitro-да тамырлауды ұсынуға болады. Бұл әдіс кейбір жағдайларда ауксиндердің ортада тұрақты болуына қарағанда қолайлы.

Микроклондарды жерге отырғызудың ең жақсы уақыты-бұл тамырлар өсе бастайтын кезең, ал жас жапырақтары жеткілікті дамыған және фотосинтезге қабілетті болады, бұл өсімдіктің толық дербестігін қамтамасыз етеді. Алдында высадкой топыраққа жарықтандыру, әдетте, арттырады дейін 10000 лк. Жарықтандырудың жоғары қарқындылығы өсімдіктердің өсуін кешіктіріп, кішкентай хлороздарды тудыруы мүмкін, алайда топырақтағы бұл өсімдіктер жарықтың жоғары қарқындылығына дейін алдын-ала қатайтылмаған өсімдіктерге қарағанда әлдеқайда жақсы және күшті өседі. Түтікшелі өсімдіктерді жерге трансплантациялаудың ең қолайлы уақыты-көктем немесе жаздың басы. Екі-үш жапырақтары мен дамыған тамыр жүйесі бар өсімдіктер колбалардан немесе пробиркалардан пинцеттермен Мұқият алынып тасталады. Тамыры агар қалдықтарынан жуылады және топырақ субстратына отырғызылады, бұрын 85-90 0С-да 1-2 сағат бойы стерильденеді.көптеген өсімдіктер үшін қоспалар субстрат ретінде келесі қатынастарда қолданылады: шымтезек : құм (3:1); шымтезек : шымтезек : перлит (1:1:1); шымтезек : құм : перлит (1:1:1). Регенерант өсімдіктері өсірілетін сүңгуірлер немесе шымтезек құмыралары алдын-ала дайындалған топырақ субстратымен толтырылады. Кемедегі қашу өсіру кезінде ауаның салыстырмалы ылғалдылығы 100% жететіні белгілі. Сондықтан қалпына келтірілген өсімдіктердің ex vitro акклиматизациясының негізгі міндеті трансплантациядан кейінгі алғашқы күндерде салыстырмалы түрде жоғары ылғалдылықты қалыптастыру болып табылады, өйткені судың едәуір жоғалуы микроклондардың өліміне әкелуі мүмкін. Өсімдіктердің жақсы өсуі үшін жасанды тұман жағдайлары жасалады. Мұндай жағдайларды жасау мүмкін болмаған жағдайда, өсімдіктер бар кәстрөлдер шыны банкалармен немесе пластикалық пакеттермен жабылған. Жоғары ылғалдылықпен жағдай жасамай, регенеранттардағы жапырақтардың өте тез төмендеуі және өсімдіктердің кейінгі өлімі байқалады. Өсімдіктердің өліміне әкелетін себептердің бірі-жапырақтардың жоғары транспирациялық белсенділігі мен тамырлардың төмен сіңіру қабілеті нәтижесінде пайда болатын су тапшылығы болуы мүмкін. Сонымен қатар, судың шамадан тыс жоғалуы in vitro өсіретін өсінділерде кутикулярлық балауыздың болмауымен байланысты болуы мүмкін. Жерге отырғызылған Өсімдіктердің өмір сүруін арттыру үшін олар қатаяды: 1-1,5 апта ішінде олардың ашық ауада болу ұзақтығы артады[7].

Үнді ғалымдары in vitro өсіретін өсімдіктердің жапырақтарын дала жағдайларына трансплантациялау кезінде тез сусызданудың алдын алудың қарапайым әдісін ұсынды: акклиматизация кезеңінде жапырақтарды глицериннің 50% Сулы ерітіндісімен немесе парафин (май) және диэтил эфирінің қоспасымен шашырату керек (1:1). Бұл әдісті қолдану пробирка өсімдіктерін қатайтудың ұзақ және қиын процестерінен аулақ болуға көмектеседі және 100% өмір сүруді қамтамасыз етеді.

Отырғызудан 20-30 күн өткен соң, жақсы тамырланған өсімдіктер Кнудсон, Мурасиг және Скуга, Чесноков, Кнопа (өсімдік түріне байланысты) тұздарымен немесе күрделі минералды тыңайтқышпен қоректенеді. Микроклондар өскен сайын олар жаңа субстраты бар үлкен контейнерлерге отырғызылады. Жерсіндірілген өсімдіктерді одан әрі өсіру осы өсімдік түрінің қабылданған агротехнологиясын өсіруге сәйкес келеді[7].