Контрольная работа по Основам биотехнологии Вариант 5 Направление подготовки
МАРКИРОВАНИЕ РАСТИТЕЛЬНОГО ГЕНОМА МЕТОДОМ ПЦР С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СЛУЧАЙНОГО ПРАЙМЕРА (RAPD)
жүктеу/скачать 172 Kb.
|
Контрольная работа Биотехнология Гущин Н.В. ЗОО 724з
| 28 МАРКИРОВАНИЕ РАСТИТЕЛЬНОГО ГЕНОМА МЕТОДОМ ПЦР С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СЛУЧАЙНОГО ПРАЙМЕРА (RAPD).
Полимеразная цепная реакция - экспериментальный метод, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе). Полимеразная цепная реакция (polymerase chain reaction, PCR) (ПЦР) позволяет существенно увеличить число копий (амплифицировать) специфического фрагмента ДНК (РНК) в исследуемой биологической пробе in vitro от ничтожно малых количеств до обнаруживаемых величин. В результате этого происходит усиление сигнала в реакционной смеси, что позволяет обнаружить и идентифицировать специфический участок генома возбудителя. В основе ПЦР лежит уникальная способность ДНК удваиваться. ДНК представляет собой двойную нить, каждая из которой состоит из нуклеотидов. ДНК реплицируется во всех живых клетках . Главная задача ПЦР - заставить специфический для данного инфекционного агента фрагмент ДНК (РНК) удваиваться in vitro в том случае, если он присутствует в пробе. При этом число образовавшиеся дочерних фрагментов ДНК также будет возрастать, в геометрической прогрессии, то есть возникнет цепная реакция, которую обеспечивает фермент Taq-полимераза. Поэтому сам метод и называется полимеразная цепная реакция. В конечном итоге происходит образование огромного числа копий искомого фрагмента ДНК, которое выявляется различными способами. Процесс увеличения числа копий искомого фрагмента ДНК называется амплификацией. Иными словами, метод ПЦР основан на многократном избирательном копировании определенного участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. С помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК, длина которых составляет не более 3000 пар оснований. ПЦР представляет собой трехэтапный циклический процесс. Обычно при проведении ПЦР выполняется 20-40 циклов, каждый из которых состоит их трех стадий. Каждая стадия протекает при определенной температуре, создаваемой в амплификаторе: денатурация (94-95 °С), отжиг праймеров (50-60 °С) и элонгация (удлинение) цепи ДНК (72 °С). [1] При выборе маркера для исследования стоит обращать внимание на полиморфность, воспроизводимость, кодоминантность (в некоторых случаях важно, чтобы в фенотипе проявлялись все аллели), трудоѐмкость маркирования и стоимость (некоторые маркеры требуют дорогостоящих методов исследования, например, секвенирование). RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA – случайно амплифицированная полиморфная ДНК) – один из первых молекулярных методов, представляющий собой проведение ПЦР (амплификацию) фрагментов ДНК с использованием одного праймера с содержанием небольшого числа произвольных нуклеотидов (около 10). Активное применение данного метода началось с конца XX века: для оценки полиморфизма среди сомаклонов; для выявления межсортовой дифференциации у одного вида растений (лён культурный – лат. «Línum usitatíssimum», ирис – лат. «Iris», каламус или ротанг – лат. «Calamus», цитрус –лат. «Citrus», манжетка – лат. «Alchemilla») и межсортовых различий и т.д. Кроме того, на основании RAPD-метода было выявлено генетическое разнообразие сосны и ели, построены генетические карты для некоторых видов растений и т.д. Преимуществами случайно амплифицированной полиморфной ДНК являются простота его проведения, дешевизна, скорость, знания нуклеотидных последовательностей не требует, является экспресс-методом для полиморфизма генома ДНК. На сегодняшний день использование RAPD-метода снизилось по причине ряда недостатков: доминантный тип наследования, что снижает точность анализа, так как невозможно отличить гетерозиготное состояние от гомозиготного; неустойчивость к изменениям условий реакций, следствием чего является снижение воспроизводимости результатов; низкая температура отжига, провоцирующая возникновение ошибок. [2] RAPD (Randomly amplified polymorphic DNA) – один из самых ранних методов маркирования. Заключается в проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами в виде коротких олигонуклеотидов со случайной последовательностью, которые садятся на рандомные участки генома. В результате для каждого исследуемого образца синтезируется набор фрагментов ДНК разной длины, которые могут отличаться у разных образцов. Можно подобрать праймеры для отличия разных видов или даже сортов. Этот метод быстр и дѐшев, однако весьма субъективен и неточен, так как на результат реакции сильно влияют еѐ условия. И можно получить разные спектры для одного и того же образца. RAPD-анализ (случайное праймирование) RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) полимеразная цепная реакция, основанная на использовании одного, обычно декануклеотидного праймера с произвольной нуклеотидной последовательностью . Методика RAPD включает: 1Экстракцию высокочистой тотальной ДНК, при этом требования к качеству ДНК более высокие, чем при обычной ПЦР. Для растений чаще всего используют методы выделения ДНК при помощи ЦТАБ (цетил-триметиламмоний бромид) из высушенного материала 2 Добавление в смесь единственного произвольного праймера. Хотя возможны варианты с использованием нескольких RAPD-праймеров в одной реакции (multiplex RAPD-PCR). 3 Полимеразную цепную реакцию (ПЦР). 4 Разделение ПЦР-фрагментов гель-электрофорезом. Чаще всего используют 1,5- 1,7% агарозный гель. 5 Визуализацию RAPD-спектра после окрашивания этидиум бромидом под ультрафиолетовым светом трансиллюминатора. 6 Определение размеров RAPD-фрагментов по сравнению с известным молекулярным маркеромс помощью программного обеспечения для анализа геля. Маркеры данного метода представляет собой продукты амплификации случайных последовательностей ДНК ограниченных произвольными олигонуклеотидными праймерами. Как и при ISSR в RAPD-методе чаще всего используется один праймер, то есть предполагается, что этот праймер отжигается во многих участках ДНК на комплементарных цепях. Количество амплифицированных фрагментов зависит от распределения и количества участков отжига по всему геному. Случайные ПЦР-продукты затем легко обнаруживаются на агарозном геле, и результирующая картина также как при ISSR представляет собой фингерпринт. Важным моментом метода является подбор оптимальной температуры отжига, которая обычно варьирует в пределах от 30 до 40ºС. Например, была проведена работа с RAPD-прймерами под условными названиями: Oligo 1, Oligo 2, Oligo 4, Oligo 6, Oligo 12 и Oligo 29 Оптимальные температуры отжига праймеров подбирались при помощи программы Oligo.net (Molecular Biology Insights, Inc). Размер RAPD-ампликонов в результате проведенной работыварьировал от 170 до 2800 п.н. [3] Многолетние научные исследования показали, что наиболее результативными в отношении решения проблем, связанных с паспортизацией генотипов, оценкой полиморфизма популяций, генетического картирования, филогенетических исследований, диагностики заболеваний и др., являются ДНК-маркеры. Из всего многообразия существующих ДНК-маркеров широкое применение получили молекулярные методы анализа RAPD, жүктеу/скачать 172 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|