Принципы клинической энзимодиагностики. Компартментализация ферментов. Изоферменты

Диагностическая энзимология основывается на 3 основных принципах в трактовке результатов.

Первый из них касается тех ферментов, которые выполняют свойственные им функции, находясь внутри клеток, а в жидкости организма попадают вследствие нарушения проницаемости клеточных мембран или даже их разрушения в результате патологического процесса. Характер и тяжесть патологического процесса определяют, какие ферменты и в каком количестве будут выходить в межтканевую жидкости, а оттуда с током лимфы в кровь и мочу. Если повреждена только наружная клеточная мембрана - выходят в основном ферменты цитоплазмы, при более глубоких поражениях клетки и повреждении мембран клеточных органелл (митохондрий, лизосом, ядер и др.) в крови появляются соответст­вующие ферменты. При остром процессе с гибелью большого числа клеток количественные изменения будут выражены более резко, чем при вяло текущем хроническом процессе. Эти изменения позволяют судить о глубине поражения и динамике повреждения.

Второй принцип в энзимодиагностике основывается на определении тех ферментов, которые реализуют свою биохимическую функцию, будучи секре-тированными из клеток в плазму крови. Понижение их активности служит при­знаком повреждения секретирующего органа.

Третий принцип - обнаружение ферментопатий, т.е. таких состояний, когда в результате генетических нарушений организм полностью или частично неспособен синтезировать какой-либо фермент.

Вследствие трудности непосредственного определения количества фермента, об их концентрации судят по вели­чине активности, что позволяет обнаруживать очень небольшие количества ферментов.

Хотя активность ферментов - это способность исследуемого материала ускорять течение соответствующей био­химической реакции, а концентрация - это количество специфического белка в единице объема, согласно международ­ной договоренности между этими понятиями, ставят знак равенства. В клинической биохимии пользуются практически всегда значениями активностей (таблица 25).

С целью унификации результатов лабораторных исследований была принята международная (интернациональная) единица ферментативной активности, которая выражается количеством микромолей превращенного субстрата или про­дукта реакции за 1 минуту. В этом случае активность фермента выражается количеством международных единиц в од­ном литре (МЕ/л или ИЕ/л). В системе СИ единицей активности фермента является катал, характеризующийся количе­ством молей превращенного субстрата или продукта реакции в секунду. Так как это очень большая величина (катал = 60000000 ИЕ), то практические расчеты проводятся с его миллиардной частью - нанокаталом (1 ИЕ=16,67 нкат). В тоже время нужно иметь в виду, что введение международной единицы и катала не решает полностью проблему унификации единиц ферментативной активности, так как различие в условиях проведения эксперимента (рН, температура, природа и концентрация субстрата, концентрация кофермента и др.) сказываются на конечном результате.

Основные пути обмена веществ являются общими для всех живых клеток. Однако в процессе эволюции произошло образование большого числа качественных и количественных модификаций этих основных форм. В организме живот­ных дифференциация на органы и ткани сопровождалась определенными биохимическими изменениями в клетках этих органов и тканей. Эти различия носили как количественный характер, выражающийся в различной интенсивности про­текающих в клетках процессов, так и качественный , обусловленный наличием в тканях реакций присущих главным образом клеткам определенных типов. Так, например, практически во всех тканях животных происходит окисление глюкозы в присутствии кислорода, но скорости этого процесса в различных тканях различны. В тоже время биосинтез стероидных гормонов происходит только в коре надпочечников, гонадах и плаценте.

Дифференциация органов и тканей в процессе роста и развития приводит к тому, что клетки специализируются в каком-то одном направлении, теряют универсальность и в них осуществляется синтез ограниченного числа ферментов необходимых для осуществления той функции, для которой предназначен данный орган или ткань.

Определяя активность ферментов в гомогенатах органов и тканей получают картину их распространения в орга­низме животного. Некоторые ферменты обладают низкой органной специфичностью и широко распространены в тка­нях, отличаясь только концентрацией, другие более специфичны и обнаруживают активность только в одном или в ог­раниченном числе источников (таблица 26).

Наибольший интерес представляют те ферменты, которые специфичны для определенных органов и тканей. Фер­мент может иметь диагностическое значение и в том случае, когда он широко распространен, но изоферментный спектр клеток различных органов и тканей будет неодинаков, как например, в случае фермента лактатдегидрогеназы.

С развитием метода дифференциального ультрацентрифугирования, была изучена клеточная локализация фермен­тов. Этот метод дает возможность разделить клеточный гомогенат на четыре фракции: ядерную, митохондриальную, микросомальную и надосадочную (растворимую). Анализ отдельных фракций показывает, что ферменты, как правило, связаны с отдельным типом частиц, хотя в некоторых случаях однотипные ферменты могут обнаруживаться в раз­личных фракциях.

В митохондриях содержатся все ферменты цикла Кребса, а также ферменты окисления жирных кислот и окисли­тельного фосфорилирования. Это структурная специфичность может быть относительна. Если окисление жирных ки­слот и окислительное фосфорилирование исключительно митохондириальные процессы, то окисление пировиноградной кислоты может происходить и в других частях клетки. Однако исключительно высокая активность этого процесса в митохондриях указывает, что именно эти частицы являются ответственными за осуществление цикла Кребса. Необхо­димо также иметь в виду, что ферменты катализирующие одну и туже реакцию и находящиеся в различных фракциях могут отличаться по своим характеристикам. Например, аспартатаминотрансфераза обнаруживается как в митохондри-альной, так и растворимой фракциях, но эти ферменты различаются по сродству к субстрату, электрофоретической под­вижностью и детерминируются различными генами. Ферменты сукцинатдегидрогеназы различаются по каталитической активности, один из них в качестве кофактора имеет НАД+, а другой - НАДФ+. В митохондриях находятся обе формы, а в цитоплазме - только НАДФ-зависимая сукцинатдегидрогеназа. Это существование функционально однотипных фер­ментов является, очевидно, приспособлением к особенностям метаболизма существующим в отдельных частях клетки.

Лизосомы содержат группу гидролитических ферментов имеющих оптимум рН около 5: катепсины, коллагеназу, глюкозидазы, эстеразы, рибонуклеазу, дезоксирибонуклеазу. Эти ферменты изолированы лизосомальной мембраной, что предотвращает в обычных условиях аутолиз (это происходит когда клетки погибают). При патологических процес­сах, под действием лекарственных веществ, токсинов бактерий и др. лизосомы могут разрушаться, что ведет к характер­ному повреждению клеток и тканей. Лизосомальные ферменты играют роль в воспалительных процессах. Считается, что такой антивоспалительный агент как кортизон, оказывает свое действие, стабилизируя лизосомальную мембрану.

Микросомальная фракция представляет собой смесь продуктов разрушения мембранной системы. В микросомаль-ной фракции находятся ферменты участвующие в биосинтезе холестерина, фосфолипидов, глицеридов. Особенно инте­ресна группа ферментов осуществляющих биотрансформацию ксенобиотиков и эндогенных соединений. Эти реакции важны и в клиническом отношении, так как этим путем выводятся как естественно образующиеся продукты метаболиз­ма (билирубин, гормоны и др.) так и многие чужеродные вещества ( например, лекарственные препараты).

В ядре обнаружено около 40 ферментов, многие из которых участвуют в реализации генетической информации.

На скорость выхода ферментов из клеток действует несколько факторов. Во-первых концентрационный градиент (разность концентраций ферментов в клетках и внеклеточной жидкости). Величина концентрационного градиента ко­леблется для различных ферментов и типов клеток в широких пределах. Соотношение внеклеточной и внутриклеточных активностей в клетках печени для аспартат и аланинаминотрансферазы составляет 1:10000, для сорбитолдегидрогеназы 1:50000. Концентрация лактатдегидрогеназы в клетках печени примерно в 3000 раз выше, чем вне клеток, а в эритроци­тах - только в 200 раз.

Вторым фактором, влияющим на скорость выхода ферментов из клеток, является размер и масса молекул фермен­тов. Диффузия ферментов происходит тем быстрее, чем меньше размеры и масса молекул. Третий фактор - внутри­клеточная локализация ферментов. Наиболее легко при незначительном повреждении клеток в кровь будут выходить ферменты цитоплазмы, тогда как при некрозе клеток будут обнаруживаться ферменты и митохондриальной и ядерной фракций.

Нарастание содержания ферментов в крови зависит от числа и степени повреждения клеток, а также скорости по­вреждения клеток. Повреждение большого числа клеток в короткие сроки приводит к резкому повышению уровня фер­ментов в крови. Например, при отравлении четыреххлористым углеродом экспериментальных животных можно полу­чить увеличение активности ферментов «печеночного» пула в десятки и сотни раз вследствие разрушения сразу боль­шого числа клеток. В то же время при циррозе, даже при значительном поражении печени, увеличение активности фер­ментов в сыворотке крови будет незначительным, так как скорости активного повреждения клеток будут небольшие.

На содержание ферментов крови влияет также скорость удаления их из кровотока. Ферменты небольшой молеку­лярной массы, типа а - амилазы могут быть удалены через почки. Однако механизм удаления большинства высокомо­лекулярных ферментов неизвестен. Очевидно их распад катализируют специфические протеазы, обуславливающие оп­ределенную скорость разрушения фермента.

В клинико-биохимических исследованиях чаще всего реализуется первый принцип, т.е. исследуются клеточные ферменты, поступившие в кровь из органов и тканей при патологии. Для исследования активности ферментов исполь­зуется чаще всего сыворотка или плазма крови. Интерпретация полученных данных основывается обычно на том, что для сыворотки крови характерны низкие значения содержания ферментов, по сравнению с их концентрацией внутри клеток.

Уровень содержания ферментов в клетках отражает процессы биосинтеза и выхода ферментов в кровь при обыч­ном обновлении клеток. Клеточная пролиферация и повышенный ферментативный синтез, повреждения или повышение проницаемости клеточных мембран приводит к усилению выхода ферментов во внеклеточные жидкости, а затем и в кровь. Развивается гиперферментемия.

Значительно реже при патологии происходит уменьшение ферментативной активности в сыворотке крови (гипо-ферментемия). Это касается тех ферментов, которые будучи синтезированы в каком-либо органе реализуют свою функ­цию в крови. Например, фермент лецетинхолестеринацилтрансфераза (ЛХАТ) находясь в плазме этерифицирует моле­кулы холестерина, перенося на них жирные кислоты, находящиеся в р - положении молекулы лецетина. При поражении паренхимы печени активность фермента резко снижается. К числу плазмоспецифических относится также холинэстера-за, разрушающая ацетил-холин и родственные ему вещества. При поражении клеток печени, и нарушении их синтетиче­ской функции происходит снижение активности этого фермента в сыворотке крови. К этой группе относятся также фер­менты свертывающей системы крови синтезируемые в печени и проявляющие свое действие, будучи секретированными в кровь.

Исследования активности органоспецифических ферментов в плазме или в сыворотке используют для решения во­проса о том, какой орган в какой степени затронут патологическим процессом. Некоторые ферменты высокоспеци­фичны, поэтому увеличение их активности в сыворотке крови позволяет по одному этому признаку сделать правильное заключение о характере заболевания. Например, резкое повышение активности фермента орнитинкарбомоилтрансфера-зы, который синтезируется только в печени, свидетельствует о поражении гепатоцитов. Трипсин вырабатывается только в поджелудочной железе, поэтому увеличение активности его в крови, свидетельствует о поражении этого органа.

Другие ферменты менее специфичны, так как они могут происходить из различных органов и тканей. Органоспе-цифичность некоторых клинически значимых ферментов представлена в таблице 26.

В клинико-биологических исследованиях широко используют, как те, так и другие ферменты. Определение высо­коспецифических ферментов имеет наибольший смысл при дифференциальной диагностике, когда четко сформу­лирована альтернатива. Однако обратной стороной специфичности является узость. Определяя специфические фермен­ты, можно подтвердить или опровергнуть только данную гипотезу. Во многих случаях оправданы и менее спе­цифические тесты. Исследуя менее специфические показатели можно сразу вычленить целую группу заболеваний.

Каждая ткань имеет свой ферментный профиль, т.е. набор ферментов наиболее характерных для данного органа или ткани и определенным образом изменяющаяся при патологии. При разрушении клеток и перехода ферментов в кровь может происходить перестройки ферментного профиля ткани связанная с неравномерной отдачей ферментов ци­топлазмы и клеточных структур, адсорбцией ряда ферментов на разрушенных тканях, инактивацией и разрушением не­которых ферментов. Потому ферментный спектр сыворотки крови характеризующий ту или иную патологию (биохими­ческий синдром) может отличаться от ферментного профиля ткани.

В клинической ветеринарии использование ферментативных методов диагностики необходимо осуществлять ком­плексно, путем одновременного определения нескольких ферментов. Диагностическая ценность исследования фер­ментов при этом значительно повышается. Одновременное использование нескольких ферментов позволяет более полно проводить дифференциальную диагностику (таблица 27).

Каталитическая активность фермента обусловлена его структурой, которая, как и всех белков, определяется последовательностью оснований определенного участка ДНК, которая кодирует данный белок. Поэтому ферментатив­ная активность в клетках следующих поколений зависит от точной транскрипции и трансляции закодированной инфор­мации. Однако в результате мутации свойства фермента могут так измениться, что он уже не сможет выполнять свою функцию.

Большинство ферментов в организме синтезируется в избытке, поэтому клиническое проявление ферментопа-тий наблюдается только у гомозигот (т.е. когда и отцовская и материнская хромосомы имеют генетические дефекты).

У гетерозигот, где хотя бы одна из хромосом обеспечивает выработку определенного количества фермента, клинические проявления ферментопатии могут отсутствовать. Это объясняется тем, что большинство мутантных фер­ментов, вызывающие врожденные пороки метаболизма, наследуются как рецессивные признаки и, следовательно, вы­ражены только у тех особей, которые гомозиготны по мутантному гену.

Для обнаружения ферментопатии чаще всего используют ферменты форменных элементов крови. Эритроциты бедны ферментами, их энергетические потребности, необходимые для поддержания их механической целостности, фор­мы и функции обеспечиваются ферментными системами гликолиза и пен-тозофосфатного пути.

Диагностическое значение исследования активности эритроцитарных ферментов значительно уже, чем плазма­тических. В клинико-диагностических целях ферменты эритроцитов исследуют для выявления тех ферментопатии, с которыми связаны заболевания красной крови. Обычно это гемолитические анемии. Известны гемолитические анемии, вызванные дефектами многих ферментов гликолиза и пентозофосфатного пути. Наиболее хорошо изучены фер­ментопатии связанные с дефектами ферментов пируваткиназы, гексокиназы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, 6-фосфоглюконатдегидрогеназы.

В некоторых случаях эритроцитарные ферменты используются для диагностики ферментопатии не связанных с патологией красной крови. В этом случае ферменты эритроцитов, служат лишь удобными генетическими маркерами. Например, дефект такого фермента эритроцитов как АТФаза, позволяет диагностировать мышечную дистрофию, фер­мента галактозо-1-фосфатуридин-трансферазы- галактоземию.

В ряде случаев клинико-биохимических исследований проводится определение изоферментов. Изоферменты -молекулярные формы одного и того же фермента. Они катализируют одну и ту же реакцию, но различаются по физико­химическим свойствам, сродством к субстрату, антигенными и другими свойствами. Множественность форм ферментов обусловлена двумя причинами. К первой следует отнести то, что в организме имеются множественные гены (ге­нетические причины), каждый из которых кодирует свою субъединицу фермента, ко второй - возможность посттрансля­ционных изменений уже синтезированных субъединиц (ферментов).

Если в клетке синтезируется две и более субъединицы и они способны соединяться друг с другом в любых комбинациях, то образуется несколько изоферментов. Изоферменты состоящие из различных субъединиц называются гибридными. Они обладают промежуточными физическими, химическими и другими свойствами. Это хорошо наблюда­ется при электрофоретическом разделении изоферментов лактатдегидрогеназы, которые состоят из субъединиц двух типов НиМ.

Из них образуются пять тетрамеров - Н₄, Н₃М, Н₂М₂, НМ₃, М₄. Наиболее высокой электрофоретической под­вижностью обладает тетрамер Н₄ (ЛДГ-1) наименьшей - ЛДГ-5 (М₄), остальные обладают промежуточной подвижно­стью. Изоферментный профиль клеток зависит от соотношения синтезируемых в ней субъединиц. Преобладать будут те изоферменты, в которые входят субъединицы содержащиеся в клетке в наибольшем количестве.

Определение изоферментов в сыворотке крови имеет важное диагностическое значение, так как распределение в тканях отдельных изоферментов более специфично, чем общей ферментативной активности. Например, в клинической диагностике довольно широко используется определение активности такого фермента, как щелочная фосфатаза. В сы­воротку крови щелочная фосфатаза поступает в основном из костной ткани, печени, кишок. Поэтому при патологии этих органов активность щелочной фосфатазы будет возрастать и дифференциальную диагностику на основании опре­деления общей активности провести нельзя. Однако «костный» и «печеночный» изоферменты различаются по своей электрофоретической подвижности и температурной устойчивостью, что позволяет проводить их раздельное определе­ние. Увеличение активности, «костного» изофермента свидетельствует о поражении костной ткани, в то время как уве­личение «печеночного» - говорит о патологии печени.

Большой интерес для клиники представляет определение изоферментов креатинфосфокиназы. Было доказано, что гибридная форма этого изофермента (MB) в большом количестве содержится только в сердечной мышце. Поэтому определение изофермента креатинфосфокиназы MB довольно специфичный показатель повреждения сердечной мыш­цы.

Существование изоферментов играет определенную роль в особенностях протекания гликолиза в мышцах и печени. Если в мышцах гликолиз призван обеспечить энергией процесс сокращения, то в печени его функции гораздо сложнее, здесь он более тесно связан с другими метаболическими путями.

Из 10 ферментов гликолиза 9 представлены в виде различных изоферментов, причем изоферментные спектры печени и мышц значительно различаются. Фосфофруктокиназа, альдолаза, пируваткиназа существуют в виде «печеноч­ного» типа, которого почти нет в мышцах, и «мышечного» типа, которого очень мало в печени животных. Фермент глю-кокиназа характерный для печени, отсутствует в мышцах. Все это свидетельствует о том, что какие-то этапы гликолиза в печени и мышцах протекают по разному и это можно использовать в целях диагностики.

Широко известно изменение изоферментных спектров органов и тканей в ходе онтогенетического развития, что связано с особенностями обмена веществ на отдельных этапах эмбрионального и неонатального периодов.

Изучение изоферментов при злокачественных опухолях показало, что специализированные зрелые формы ферментов заменяются на более ранние эмбриональные формы. Установлено, что при гепатоме, изоферменты альдола-зы, характерные для печени взрослого животного заменяются эмбриональными формами. Фермент гексокиназа IV, ха­рактерный для зрелых гепатоцитов, в опухолях заменяется на гексокиназу I и II, характерных для печени эмбриона.

В печени взрослых животных преобладает изофермент пируваткиназа I (печеночный тип) и в небольших коли­чествах содержится пируваткиназа III (почечный тип). Было установлено, что в малодифференцированных быстро рас­тущих опухолях наблюдается обратная картина: количество изофермента I снижается, вплоть до полного исчезновения, тогда как активность изофермента Ш резко повышается.