Некоторые методы молекулярной биологии Денис Ребриков Полимеразная цепная реакция

Некоторые методы молекулярной биологии

• Денис Ребриков

Полимеразная цепная реакция

• Принцип ПЦР сформулировал Гобинд Корана в 1971
• В 1983 Кэри Мюллису удалось провести ПЦР

• В 1993 за изобретение ПЦР Кэри Мюллису вручена Нобелевская премия по химии

Выявление патогенов

• Инфекции крови (качественное и количественное определение)
• ИППП
• Эпидемические инфекции
• Исследование биоценозов
• и др. …

Исследование генома

• ПЦР позволяет определять вставки, делеции или однонуклеотидные замены в геномной ДНК
• Сейчас с помощью ПЦР диагностируют более 200 наследственных заболеваний, таких как:
• Фенилкетонурия
• Муковисцидоз
• Миодистрофия Дюшенна/Беккера
• Хорея Гентингтона
• Гемофилия А, В
• Болезнь Вильсона-Коновалова
• и др. …

Исследование мРНК

• Относительная экспрессия в двух образцах
• Определение абсолютного кол-ва копий мРНК на клетку

• контроль за использованием ГМ организмов (ГМО)
• контроль за наличием и процентным содержанием ГМ ингредиентов (ГМИ) в пище
• Определение вида и индивида

• ПЦР позволяет осуществлять:

• Мониторинг живых систем

Принцип ПЦР

Экспоненциальная амплификация

Программа амплификации

• Денатурация ДНК
• Отжиг праймеров
• Достройка праймеров
• Число циклов

Компоненты реакции

• вода
• буфер
• dNTP
• праймеры
• полимераза
• зонды, интеркаляторы
• масло

Оборудование для ПЦР

«Проявка» хода реакции

• Флуоресцентные красители и тушение флуоресценции
• 5’-экзонуклеазная активность Taq-полимеразы

• Гибридизационные методы

• Меченые праймеры

• Меченые зонды

• Sunrise=Amplifluor™

• Scorpions™

• TaqMan

• Beacons

• kissing probes=
• adjacent probes

• Complementary oligos

Разгорание пробы

• Принцип флуоресцентной детекции

Форма графиков накопления ДНК

Форма графиков накопления ДНК

• начало быстрого падения Е

• Е почти константа

• Результаты ПЦР на образцах с одинаковым количеством ДНК

Вычитание геномов

• Денис Ребриков

На Земле существует около 2,5 млн видов живых существ. Все это разнообразие определяют различия в строении геномов отдельных видов.

• На Земле существует около 2,5 млн видов живых существ. Все это разнообразие определяют различия в строении геномов отдельных видов.
• Организм человека состоит из примерно 210 основных типов клеток, существенно отличающихся фенотипически. Это разнообразие связано с различными вариантами экспрессии одного и того-же генома.

Сравнение кДНК для поиска дифференциально экспрессируемых генов

Сравнение бактериальных геномов для поиска штаммо-специфичных генов

Сравнение эукариотических геномов для поиска видо- и расаспецифичных последовательностей

• ?

Для поиска дифференциально представленных молекул применяют методы вычитающей гибридизации

Принцип метода

• Амплификации после SSH подвержены только молекулы с разными адаптерами

Эффективность применения SSH

• Упрощение с варьирующими параметрами

• Анализ на полиакриламидном геле

• Стратегия дифференциального дисплея

• Опухолевая трансформация

• А

• В

• Выделение РНК

• ~2 x104 видов мРНК

• А

• В

Использование УДД для поисков маркеров различных регионов тела планарии

• 3c

• 2а

Информация о компании ЗАО «НПФ ДНК-Технология»

• Основана в 1993 году
• Специализация: производство оборудования и реактивов для ПЦР, лабораторная диагностика
• Состояние на январь 2007 года
• более 170 сотрудников, из них 20 - кандидаты наук
• собственная научная база для работ в области генной и белковой инженерии, синтеза олигонуклеотидов, секвенирования ДНК, разработки оборудования
• собственное производство оборудования и диагностических наборов
• диагностическая лаборатория для всех видов исследований

жүктеу/скачать 4,91 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: