Оқулық Ә.Ә. Шортанбаев, С. В. Кожанова. Алматы, 2008. 2


Иммунды флюоресценттiк сынамада жасушаларды бояу әдiстерi



Pdf көрінісі
бет291/313
Дата11.06.2024
өлшемі10,03 Mb.
#203315
түріОқулық
1   ...   287   288   289   290   291   292   293   294   ...   313
Байланысты:
shortanbaev e e kozhanova s v zhalpy immunologiya okulyk

Иммунды флюоресценттiк сынамада жасушаларды бояу әдiстерi
1. Лимфоциттердi верографин (урографин) - фиколл градиентiнде 
центирфугалаған (айнылдырған) (тығыздығы 1.077 г/мл) (Boyum, 1968) 
гепаринденген веноздық қаннан бөлiп алады; 
2. Лимфоциттердi 
центрифугалық 
пробиркаға
 
немесе 
96-лункалық 
планшетке 50 мкл көлемде 1 мл-ге 2 млн мөлшерде енгiзедi. 
Жасушаларға 5 мкл сынамалайтын моноклонды антиденелер ерiтiндiсiн 
қосады және +4
о
С 30-45 мин. инкубациялайды;
3.
150 мкл Хенкс ерiтiндiсiн қосып, 200g 5 мин центрифугалайды;
4.
Супернатантты алып тастайды. Содан соң 50 мкл Хенкс ерiтiндiсiн 
енгiзедi, жасушаларды суспензиялайды, 150 мкл Хенкс ерiтiндiсiн 
қосып, 200g 5 мин. центрифугалайды; 
5.
Супернатантты алып тастайды. Жуылған жасушалардың тұнбасына 
тышқан 
Ig-не 
ФИТЦ
 
белгiленген 
және 
1:100 
ерiтiлген 
қой 
антиденелерiнiң 50 мкл F(ab)2-фрагментiн қосады. Ерiту үшiн құрамы 
0,5%желатиннен және 0,1% натрий азидiнен тұратын, фосфатпен 
буферленген (PBS) (PBS Хенкс ерiтiндiсiн қолдануға болады) физ. 
ерiтiндiнi қолданады. Жасушаларды суспензиялайды және +4
о
С 30 мин. 
инкубациялайды; 
6.
пп. 3-4 көрсетiлгендей жасушаларды 2 рет жуады;
7.
Жасушалар иммунды флюоресценциямен қарауға дайын, бiрақ егер де 
сынаманың нәтижесiн бiрнеше сағаттан соң алатын болсақ, онда 
жасушаларды бекiтедi. Ол үшн соңғы рет центрифугаланғаннан және 
супернатаны алып тастағаннан кейiн жасушалар тұнбасына PBS-ке
(PBS-ке 1:40 ерiтiлген формалин ерiтiндiсiн қолдануға болады) 50 мкл 
1% 
параформальдегидтi 
қосады. 
Жасушаларды 
суспензиялайды. 
Бекiтiлген жасушалар флуоресценциясын бiрнеше апта бойы сақтайды. 
Боялған жасушаларды ағымды
 
цитофлуориметрде талдайды немесе 
флуоресценттiк микроскоп арқылы қарайды. Соңғы жағдайда жасушаларды 
суспензиялайды, суспензияны заттық әйнекке ауыстырады, жабынды 
әйнекпен жабады және препаратты флуоресценттiк микроскоппен (объектив 
х90) иммерсия астында қарастыралады. Суреттiң сапасын жоғарылату үшiн 
окулярдың аз ғана үлкейгiштiгiн (х3 немесе х1,7) қолданады. Флуоресценттiк 
емес иммерсионды майды қолданған жөн. Бақылауды қараңғы бөлмеде 
жүргiзген дұрыс. Терiс бақылау препаратында бақыланатын антиген-


позитивтiк 
жасушалардың 
санын, 
200 
лимфоциттердi 
қарағанда 
флуоресценттi 
жасушалардың 

алып 
тастағанда, 
флуоресценттiк 
жасушалардың % ретiнде анықтайды. Терiс бақылау ретiнде, сол бойынша 
ұқсас дайындалған, бiрақ моноклонды антиденелердiң орнына жасушаларды 
Хенкс ерiтiндiсiмен немесе қалыпты тышқан Ig өңделген препараттарын 
қолданады.
Қан сарысуындағы және басқа да биологиялық сұйықтықтағы 
иммуноглобулиндердiң әр класының және топшаларының (изотиптердiң) 
концентрациясы В-лимфоциттердiң және де барлық гуморалдық иммунды 
жауаптың реттелу жүйесiнiң функционалдық жарамдығын көрсететiн негiзгi 
интегралды көрсеткiш болып табылады.
Иммуноглобулиндердiң әр класының (IgA, IgG, IgM, IgE) санын 
анықтайтын 
аспаптары 
ретiнде 
әр 
класына 
тән 
арнайы 
антииммуноглобулиндi 
антидене 
болып 
табылады. 
Соңғы 
кездерi 
иммуноглобулиндерiң әр класына тән, әр түрлi антигендiк детерминантқа 
(эпитоп) қарсы қолданатын моноклонды антиденелерге көңiл бөледi.
Әдеттегiдей 
сарысулық 
иммуноглобулиндердiң 
концентарциясын 
поликлондық антиденелердi қолдану арқылы, 


Достарыңызбен бөлісу:
1   ...   287   288   289   290   291   292   293   294   ...   313




©engime.org 2024
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет