Оқулық Ә.Ә. Шортанбаев, С. В. Кожанова. Алматы, 2008. 2
Иммунды флюоресценттiк сынамада жасушаларды бояу әдiстерi
жүктеу/скачать 10,03 Mb. Pdf көрінісі
|
shortanbaev e e kozhanova s v zhalpy immunologiya okulyk
| Иммунды флюоресценттiк сынамада жасушаларды бояу әдiстерi
1. Лимфоциттердi верографин (урографин) - фиколл градиентiнде центирфугалаған (айнылдырған) (тығыздығы 1.077 г/мл) (Boyum, 1968) гепаринденген веноздық қаннан бөлiп алады; 2. Лимфоциттердi центрифугалық пробиркаға немесе 96-лункалық планшетке 50 мкл көлемде 1 мл-ге 2 млн мөлшерде енгiзедi. Жасушаларға 5 мкл сынамалайтын моноклонды антиденелер ерiтiндiсiн қосады және +4 о С 30-45 мин. инкубациялайды; 3. 150 мкл Хенкс ерiтiндiсiн қосып, 200g 5 мин центрифугалайды; 4. Супернатантты алып тастайды. Содан соң 50 мкл Хенкс ерiтiндiсiн енгiзедi, жасушаларды суспензиялайды, 150 мкл Хенкс ерiтiндiсiн қосып, 200g 5 мин. центрифугалайды; 5. Супернатантты алып тастайды. Жуылған жасушалардың тұнбасына тышқан Ig-не ФИТЦ белгiленген және 1:100 ерiтiлген қой антиденелерiнiң 50 мкл F(ab)2-фрагментiн қосады. Ерiту үшiн құрамы 0,5%желатиннен және 0,1% натрий азидiнен тұратын, фосфатпен буферленген (PBS) (PBS Хенкс ерiтiндiсiн қолдануға болады) физ. ерiтiндiнi қолданады. Жасушаларды суспензиялайды және +4 о С 30 мин. инкубациялайды; 6. пп. 3-4 көрсетiлгендей жасушаларды 2 рет жуады; 7. Жасушалар иммунды флюоресценциямен қарауға дайын, бiрақ егер де сынаманың нәтижесiн бiрнеше сағаттан соң алатын болсақ, онда жасушаларды бекiтедi. Ол үшн соңғы рет центрифугаланғаннан және супернатаны алып тастағаннан кейiн жасушалар тұнбасына PBS-ке (PBS-ке 1:40 ерiтiлген формалин ерiтiндiсiн қолдануға болады) 50 мкл 1% параформальдегидтi қосады. Жасушаларды суспензиялайды. Бекiтiлген жасушалар флуоресценциясын бiрнеше апта бойы сақтайды. Боялған жасушаларды ағымды цитофлуориметрде талдайды немесе флуоресценттiк микроскоп арқылы қарайды. Соңғы жағдайда жасушаларды суспензиялайды, суспензияны заттық әйнекке ауыстырады, жабынды әйнекпен жабады және препаратты флуоресценттiк микроскоппен (объектив х90) иммерсия астында қарастыралады. Суреттiң сапасын жоғарылату үшiн окулярдың аз ғана үлкейгiштiгiн (х3 немесе х1,7) қолданады. Флуоресценттiк емес иммерсионды майды қолданған жөн. Бақылауды қараңғы бөлмеде жүргiзген дұрыс. Терiс бақылау препаратында бақыланатын антиген- позитивтiк жасушалардың санын, 200 лимфоциттердi қарағанда флуоресценттi жасушалардың % алып тастағанда, флуоресценттiк жасушалардың % ретiнде анықтайды. Терiс бақылау ретiнде, сол бойынша ұқсас дайындалған, бiрақ моноклонды антиденелердiң орнына жасушаларды Хенкс ерiтiндiсiмен немесе қалыпты тышқан Ig өңделген препараттарын қолданады. Қан сарысуындағы және басқа да биологиялық сұйықтықтағы иммуноглобулиндердiң әр класының және топшаларының (изотиптердiң) концентрациясы В-лимфоциттердiң және де барлық гуморалдық иммунды жауаптың реттелу жүйесiнiң функционалдық жарамдығын көрсететiн негiзгi интегралды көрсеткiш болып табылады. Иммуноглобулиндердiң әр класының (IgA, IgG, IgM, IgE) санын анықтайтын аспаптары ретiнде әр класына тән арнайы антииммуноглобулиндi антидене болып табылады. Соңғы кездерi иммуноглобулиндерiң әр класына тән, әр түрлi антигендiк детерминантқа (эпитоп) қарсы қолданатын моноклонды антиденелерге көңiл бөледi. Әдеттегiдей сарысулық иммуноглобулиндердiң концентарциясын поликлондық антиденелердi қолдану арқылы, жүктеу/скачать 10,03 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|