ӘОЖ 632.938: 576.8(043.2)

216
Медициналық тәжірибеде трихинеллезға диагнозды иммунологиялық әдістермен 
(ИФТ, КБР және т.б.) қояды. Жануарларға диагнозды көбінесе өлгеннен кейін – трихинел-
лоскопия әдістерімен немесе жасанды асқазан сөліндегі қорыту әдістерімен қойылады 
[2]. 
Иммунохимиялық тест жүйелері медициналық және ветеринариялық диагностикада
кеңінен қолданылады. Індеттің бар-жоғын сенімді анықтауға мүмкіндік береді. Бірқатар 
аурулар үшін телімді антигендер мен антиденелерді диагностикалық бақылаудың негізгі 
құралы болып табылады [3].
Иммунологиялық әдістер қандағы телімді антиген мен антиденелді анықтауға 
негізделген. Иммунологиялық әдістердің ішінде телімділігі мен сезімталдылығы жак-
сы әдіс ол – имунды хромотографиялық талдау (ИХТ). Жоғарыда айтылғандарды ескере 
отырып, біз трихенеллез қоздырғышын анықтау үшін жедел-тест жасау бойынша зерт-
теулер қымбат құрал-жабдықтарды қолданбай жүзеге асыру міндетін қойдық. Реакция 
компоненттерінің иммунохимиялық әрекеттесуі 15-20 минут ішінде жүргізуге мүмкіндік 
береді [4,5]. Мұндай тесттерді құрастыру бірнеше компоненттерді жасауды талап етеді, 
олардың негізгісі конъюгат (коллоидты алтынмен таңбаланған поликлонды антидене-
лер).
Жұмыстың мақсаты – поликлоналды антидене мен коллойдты алтын
нанобөлшектерінің конъюгациялау параметірлерін оңтайландыру. 
Зерттеу материалдары мен әдістері. 
Зерттеу жұмыстары Қазақстан Республикасының Ғылым және Жоғары білім 
министрілігі қаржыландыратын № AP09058176 «Трихинеллезді балауға арналған экспресс 
– тест» ғылыми жоба тақырыбы аясында С.Сейфуллин атындағы Қазақ агротехникалық 
университетінің Ауылшаруашылық Биотехнологиясының Ғылыми-Зерттеу Платформа-
сында жүргізілді.
Зерттеудің материалдары мен әдістері. Зертханалық жануарларды трихинеллездің 
антигендерімен иммундеу арқылы алынған телімді поликлоналды антиденелер 
қолданылды. Алтын-хлорсутекті қышқылының сутегі ерітіндісі HAuCl4 («Sigma-
Aldrich», АҚШ), саңылауларының диаметрі әр түрлі нитроцеллюлозды мембраналар 
CNPF (5 μ), CNPF (8 μ), CNPF (10 μ), CNPC (15 μ), үлгі енгізіге арналған мембраналар 
(TYPE-GBF-R7L), коллойдты алтынды конъюгаттын енгізуге арналған талшықты мем-
браналар (TYPE-RT-R5) және адсорбциялаушы мембраналар (TYPE-AP-045) өндіруші 
компания Advanced Mіcrodevіces (Ambala Cantt, Үндістан). 
Коллоидты алтынды дайындау. Бөлшектердің қажетті мөлшері бар коллоидты ал-
тын ерітінділерін Френс әдісімен жасалды [6]. Бұл үшін 0,01% алтын-хлорсутегі
қышқылының сутегі ерітіндісі HAuCl4 ("Sigma") колбада қайнағанға дейін магнитті 
араластырғышта қыздырып, белсенді араластыра отырып 1 % натрий цитратының 
ерітіндісін қостық. Ерітіндіні 15 мин қайнатып, содан соң суытып 4-6 °С-та сақтадық. 
Антидене (ПКА) конъюгаттары мен коллоидты алтын нанобөлшектерін оңтайландыру
үшін 3 әдіс қолданылды.
Бірінші әдіс. КА ерітіндісінің рН-ы калий карбонатымен 8.5-ке жеткізілді, содан 
кейін рН 8.5 болатын 10 мм Tris-HCl буферіндегі антиденелер (ПКА және ) мен БСА 
ерітінділері тамшылатып қосылды. Инкубациядан кейін 30 минут ішінде алынған конъ-
югатты байланыспаған антиденелерден үш рет 10 000 айн/мин центрифугалау арқылы 30 
минут ішінде тазарту жүргізілді.
Екінші әдіс. 10 мл коллоидты алтын ерітіндісінің рН 7,0-7,5 жеткізіп, 1 мл антиде-
не ерітіндісін тамшылатып косып 30 минут бойы араластырамыз. Содан кейін алынған 
ерітіндіге соңғы концентрацияға дейін 1% БСА және Tris-HCl қосылды. Байланыспаған 
антиденелерден тазалау үшін конъюгат центрифугаланады (30 мин, 11000 айн/мин, 4°C). 
Тұнба үстіндегі сұйықтық алынып тасталады, тұнба қажетті мөлшерде 1% БСА қосылған 
Tris-HCl буферімен қайта ерітіледі. Дайын конъюгат +4°C температурада сақталды.

217
Үшінші әдіс. Коллоидты алтынның 10 мл ерітіндісінің рН-ын 9-ға калий карбонаты-
мен жеткізілді. 10 мм Tris-HCl буферіндегі антиденелер (ПКА және Protein A) мен БСА 
ерітінділері тамшылатып қосылды. Инкубациядан кейін 30 минут ішінде алынған конъ-
югатты байланыспаған антиденелерден үш рет 10 000 айн/мин центрифугалау арқылы 
тазарту жүргізілді.Тұнба 1% БСА қосылған Tris-HCl буферімен қайта ерітіледі.
Жасалған конъюгаттардың белсенділігін нитроцеллюлоза мембранасында (НЦМ) 
ИФТ «нүктелік» қойылымы арқылы тексерілді. Трихинеллездің антигені нитроцеллю-
лоза мембранасының жолақтарына 1:1 сұйылтудан бастап фосфатты тұз ерітіндісіде 
(ФТЕ) титрленіп 1 мкл мөлшерінде енгізілді. Бейспецификалық адсорбция болдырмау 
мақсатында, НЦМ 1%-ды БҚС көмегімен бекітілді. Реакцияның әр сатысында НЦМ 
жолақшалары Tween-20 қосылған ФТЕ буферінде 3 рет жуылды. Реакцияның келесі са-
тысында дайындалған конъюгат ерітінділері енгізіліп, 15 минут бойы термостатта инку-
бацияланды. Реакция нәтижелері визуалды түрде бағаланды. Нәтижесінде үшінші әдіс 
боыйнша жасалған конъюгат трихинелла антигенімен жақсы байланысты және оның 
титрі 1:8 – 1:16 қатынсаында болды. Ал бірінші және екінші әдіс бойынша әзірленген 
конъюгаттардың антигенмен байланысу титрі төмен (1:1 – 1:2) болды.
Жасалған жұмыстардың нәтижесінде поликлоналды антидене мен коллойдты алтын
нанобөлшектерінің конъгация параметрлерін оңтайландырылды және конъюгаттардың 
қажетті мөлшері алынды. Конъюгат әзрлеу үшін қолданылған Protein A оңтайлы концен-
трациясы 5 мкг/мл құрады, ал ПКА – 0,1 мг/мл. Көрсетілген деңгейден антиденелерді 
көп енгізу фондық сигналдың пайда болуына әкеледі. Осылайша, трихинеллезге телімді 
антиденелер мен коллоидты алтын нанобөлшектерінің конъюгаты дайындалды және 
алынған конъюгаттар трихинеллез індетін балау үшін иммунохроматографиялық тест 
құрастыруда қолданылады.

жүктеу/скачать 5,46 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: