Реферат создание моноклональных антител (мка) привело к рево
жүктеу/скачать 1,33 Mb. Pdf көрінісі
|
monoklonalnye-antitela-ot-sozdaniya-do-klinicheskogo-primeneniya (1)
ЕҚБҮ, 2б-Силлабус ДБ 7 кур каз, Маяқұм ауылдық мәдениет үйінің 2022 жылғы желтоқсан айының күзетшілер кестесі, DOC-20231110-WA0001.
| основном пути
синтез нуклеотидов de novo осуществляется из аминокислот и углеводных пред- шественников, а при резервном — из гипоксантина (пурины) или дезокситимидина (пиримидины). Если по каким-либо причинам основной метаболиче- ский путь синтеза нуклеотидов блокируется (например, аминоптерином), то в нормальных клетках используется резервный путь синтеза нуклеотидов. В такой ситуации включаются в работу ферменты гипоксантин-гуанидин- фосфорибозилтрансфераза (Г/ГФРТ) и тимидинкиназа, что обеспечивает синтез нуклеотидов по запасному пути. Для гибридизации с В-лимфоцитами были отобраны только мутантные клетки миеломы, у которых не синте- зируется Г/ГФРТ, т. е. у них имелся только основной путь синтеза нуклеотидов. Мутантные клетки миеломы способны синтезировать нуклеотиды только по основному метаболическому пути. Если в среду для культивирования внести вещество, блокирующее основной путь синтеза нуклеотидов в клетке, — аминоптерин, то в данной среде миеломные клетки, у которых отсутствует Г/ГФРТ, не способны обе- спечить синтез нуклеиновых кислот и погибают. Мутантные клетки гибридомы лишены резервного пути синтеза нуклеотидов, и в среде с гипоксантином они погибают. Задача селекции сводится к отделению гибридом от миеломных неслившихся клеток. Для решения этой за- дачи используют селективную среду ГАТ (культуральная среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин). В такой среде, содержащей аминоптерин, блокируется основной путь синтеза нуклеотидов, а наличие гипо- ксантина и тимидина обеспечивает синтез нуклеотидов по запасному пути. В этих условиях миеломные клетки погибают и функционально активными остаются только гибридомы. В-лимфоциты не адаптированы к росту in vitro , они достаточно быстро разрушаются, что облегчает процесс селекции. Рис. 1. Цезарь Мильштейн (Cesar Milstein) и Георг Кёлер (George Kohler) Fig. 1. Cesar Milstein and George Kohler Цезарь Мильштейн (Cesar Milstein) Георг Кёлер (George Kohler) 239 Моноклональные антитела www.medprint.ru Таким образом, мышей иммунизировали опре- деленным антигеном — белком. После выявления антител в крови из селезенки иммунизированных жи- вотных готовили взвесь клеток с большим содержанием В-лимфоцитов. В системе in vitro слияние соматических клеток было осуществлено с помощью ПЭГ, а отбор жела- емого клона гибридных клеток выполнялся с использова- нием селективной питательной среды ГАТ, где гибридомы способны непрерывно расти в культуре и продуцировать антитела. Выбранные гибридомы затем культивируют для получения больших количеств моноклональных антител (МКА), не содержащих посторонних антител и настолько однородных, что могут рассматриваться как чистые химические реагенты. Следует отметить, что антитела, продуцируемые одной культурой гибридом, связываются только с одной антигенной детерминантой (эпитопом). В связи с этим к антигену с несколькими эпитопами можно получить столько МКА, сколько имеется антигенных детерминант, и можно отобрать клоны, продуцирующие антитела только одной нужной специфичности [2]. Для получения больших объемов жидкости, содер- жащей МКА, гибридомы могут быть введены внутрибрю- шинно мышам-реципиентам. В результате в брюшной полости размножаются гибридомы и накапливается ас- цитическая жидкость, являющаяся источником большого количества МКА. В последние годы гибридомы размно- жают в аппаратах, приспособленных для выращивания культур клеток (рис. 2). Таким образом, в отличие от поликлональных гетеро- генных сывороток, содержащих большое разнообразие антител, которые отличаются своей специфичностью, аффинитетом и физико-химическими свойствами, пре- параты МКА содержат продукт единственного клона плазматических клеток, направленного к строго опреде- ленной антигенной детерминанте и обладающего всегда одинаковыми физико-химическими характеристиками и сродством к антигену. Разработка технологии получения гибридом имела революционное значение в иммунологии, молекулярной биологии и медицине и позволила создать совершенно новые научные направления. Благодаря гибридомам возникли новые методы диагностики многих заболеваний и открылись новые пути для изучения злокачественных опухолей и многих других заболеваний. Ученые, раз- работавшие технологию получения МКА, в 1984 г. стали лауреатами Нобелевской премии. Таким образом, клоны — продуценты МКА (гибри- домы) получают слиянием антителообразующих клеток лимфоидной ткани иммунизированного животного и клеток плазмоцитомы. Полученные в результате клетки наследуют от В-лимфоцитов способность к синтезу специ фических антител, а от клеток миеломы — спо- Рис. 2. Основные этапы получения гибридомы Fig. 2. Key steps of obtaining hybridoma Мыши вводят специфический антиген, который вызывает продукцию антител против этого антигена. Селезенку мышей удаляют и гомогенизируют для получения суспензии клеток. Эта суспензия содержит B-клетки, которые продуцируют антитела против введенного антигена. Клетки селезенки затем смешивают с клетками миеломы, которые способны непрерывно расти в культуре, в них также отсутствует резервный путь синтеза нуклеотидов. Некоторые антителопродуцирующие клетки селезенки и клетки миеломы сливаются, образуя гибридные клетки. Эти гибридные клетки теперь способны непрерывно расти в культуре и продуцировать антитела. Антиген Селезенка Суспензия клеток селезенки (В-лимфоциты) Культура миеломных клеток Суспензия миеломных клеток Клетки селезенки Миеломные клетки Миеломные клетки Гибридные клетки Смесь клеток помещают в селективную среду, которая позволяет расти только гибридным клеткам. Погибают неслившиеся миеломные клетки и В-лимфоциты. Гибридные клетки пролиферируют, образуя клон гибридом. Гибридомы проверяют на продукцию нужных антител. Выбранные гибридомы затем культивируют для получения больших количеств моноклональных антител. В-лимфоциты Гибридные клетки Гибридомы Желаемые моноклональные антитела 240 Ю.И. Будчанов К ЛИНИЧЕСКАЯ ОНКОГЕМАТОЛОГИЯ собность к неограниченному росту in vitro и продукции иммуноглобулинов. В 1998 г. Г.И. Абелевым также опубликована схема получения моноклональных антител (рис. 3). После недолгого культивирования одиночные АОК, а также гибриды АОК и АОК погибали, т. к. нормальные В-лимфоциты (АОК) смертны (быстро погибают) в куль- туре. Они не способны длительно культивироваться. Клетки плазмоцитомы и их гибриды также погибали, т. к. аминоптерин блокировал основной путь синтеза предшественников нуклеиновых кислот, а гипоксантин и тимидин их не спасали. Следовательно, выживали только гибриды АОК и плазматических клеток, т. к. бессмертие они унаследовали от плазмоцитомы, а резервный путь — от нормальной В-клетки. Такие гибриды (гибридомы) сохраняли способность синтезировать и секретировать антитела, а также пролиферировать. Следующий этап после получения гибридом — кло- нирование и отбор нужных клонов. Выжившие в ГАТ клетки рассевали в пластиковые планшеты. В каждую лунку помещали в среднем по 10 гибридомных клеток. После нескольких дней культивирования содержимое каждой лунки проверяли на присутствие антител нужной специфичности. Клетки из лунок, содержащих нужные антитела, клонировали, т. е. повторно рассевали по лункам, но из расчета 1 клетка на лунку, вновь культи- вировали и проверяли на присутствие нужных антител. Процедуру повторяли 1–2 раза. Таким образом, отбирали клоны, продуцирующие антитела только одной нужной специфичности, т. е. жүктеу/скачать 1,33 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|