Сбор микроводорослей в природе и получение альгологически чистых популяций

Если при экологическом изучении водорослей стремятся к созданию для каждой формы условий, наиболее приближающихся к условиям их роста и развития в природе, то при массовой работе по выделению культур микроводорослей из природы связи с предъявляемыми к ним требованиями следует обращать особое внимание как на условия получения накопительных и альгологических чистых культур, так и на места отбора проб.

Места отбора проб. Пробы должны браться из хорошо прогреваемых водорослей в районах с высокой инсоляцией. Водоемах отдается предпочтение перед почками в связи с большей вероятностью выделения форм, обладающих резко автотрофными свойствами и с менее выраженной склонностью к гетеротрофному обмену.

Значительный интерес могут представлять хорошо просвечиваемые мелкие пруды и лужи. При выделении термофильных форм перспективными могут оказаться холодильные пруды электростанций, водоемы южных районов и районы близ горячих источников. Многие исследователи обращают внимание на возможность получения активных форм при выделении так называемых эфемерных видов, т.е. видов, активно живущих недолгий срок и потому дающих в период развития пышный рост, что особенно характерно для северных районов. Однако при выделении таких форм следует в дальнейшем особое внимание уделить проверке наличия у них сезонности в развитии, что отмечено для многих форм и может быть особенно ярко выражено у эфемерных типов.

Сосуды с засеянным материалом помещают на стекло над рамой с закрепленными люминесцентными лампами (рис. 1, 2) , или на окно на естественный свет (но не прямой солнечный) так , чтобы освещенность колб соответствовала приблизительно 6 – 10 тыс . люкс.

Для отбора термофильных форм пробы следует помещать в люминостат с температурой 30⁰ или выше (до 40⁰). Для получения накопительных культур одноклеточных протококковых водорослей хорошие результаты дает применение среды Прата , а также Чо-10 (Cho-10); последняя пригодна также для выращивания сине-зеленых диатомовым водорослей. Однако это среды с очень низкими содержанием питательных солей; наряду с такими средами необходимо вести отбор сразу на более концентрированных питательных средах, например на среде Майерса или Тамия (рецептура сред дается в приложении II).

Получение альгологически чистых культур.

Из накопительной или обогащенной культуры получают альгологически чистую культуру. Наиболее ценной чистой культурой считается культура, полученная из одной клетки. Это трудный вариант получения чистой культуры. Часто чистые культуры получают из колонии или группы клеток. В этом случае чистая культура представляет собой популяцию, в которой при длительном культивировании могут преобладать те или иные клетки, что может вызвать изменение свойств данной культуры водорослей. В связи с этим следует отдавать предпочтение штаммам или клонам водорослей, выделенным из одной клетки.

Для выделения альгологически чистой культуры из накопительной используют обычные микробиологические методы - разведения, пересевов, выделения клеток с помощью микроманипулятора. Последний наиболее надежен, но и максимально сложен.

Чаще всего используют метод пересевов на агаризованных средах. С этой целью небольшой объем накопительной культуры (1 см³ или больше в зависимости от ее чистоты) стерильно высевают на чашку Петри с агаризованной питательной средой, распределяя посев по поверхности петлей. Чашки помещают на свет для роста микроводорослей. Из выросших колоний, скоплений трихомов петлей переносят часть культуры вновь на жидкую среду или косяк. При многократных (до 10-20 раз) пересевах и при использовании для засева на чашку достаточно разведенных суспензий можно считать, что каждая колония вырастает из отдельной клетки.

Для получения чистых культур водорослей, плохо развивающихся на агаризованных средах, можно использовать двухслойные среды: на агаризованный косяк наливают тонкий слой жидкой питательной среды (2-5 мм).в такой среде водоросли развиваются как бы на поверхности раздела двух сред, что интенсифицирует их размножение.

Альгологически чистые культуры выделяют при самом тщательном микроскопическом контроле. Нужные организмы, хорошо различимые в лупу 10 – 20-кратного увеличения, можно вылавливать с помощью пипеток или капилляров. Если исходный материал попадается в небольшом количестве, необходимо его сконцентрировать фильтрованием пробы через предварительный фильтр. Для выделения отдельных организмов удобнее пользоваться микроскопом МБС-1.

При выделении чистых культур водорослей можно использовать их подвижность и реакцию на свет. Обычно все подвижные формы накапливаются в освещенной части сосуда, откуда их легко выделить. Таким же способом из смешанной культуры выделяют и сравнительно крупные организмы, например Volvox, Pandorina, Eudorina, которые видны невооруженным взглядом. Так же можно выделить и мелкие формы, например Chlamydomonas, если они находятся в большом количестве.

Эту особенность в реакции на свет можно использовать и для выделения осциллаторий из дерновинок и пленок. Выделить отдельные нити осциллаторий обычным путем, не повредив их, очень трудно, так как они в пленках сильно переплетаются между собой и, кроме этого, содержат другие формы, от которых обычно трудно бывает избавиться в культурах. При выделении культуры небольшую пленку или дерновинку осциллаторий, помещают в чашку Петри или кристаллизаторы с дистиллированной водой или питательным раствором. Одну сторону сосуда затеняют черной бумагой и выставляют его на свет. В результате проявления фототаксиса живые нити осциллаторий передвигаются к освещенной стороне кристаллизатора.

Для получения чистых культур ряда водорослей (Stigeoclonium, Draparnaldia, Oedogonium, Ulothrix) удобно воспользоваться их способностью образовывать зооспоры, что можно вызвать помещением водорослей в атмосферу с содержанием 5% СО₂ (в вакуум-эксикаторе).

Питательные среды

Выделенную альгологически чистую культуру водоросли выращивают на питательной среде. Известно очень много рецептов питательных сред.

Используемые для культивирования водорослей среды разделяют по их консистенции на две категории – жидкие и твердые.

Жидкие среды готовят на водопроводной или дистиллированной воде. Водопроводную воду для приготовления сред отстаивают, кипятят, фильтруют через фильтр или вату. Раствор микроэлементов к водопроводной воде обычно не добавляют. Для приготовления питательной среды водопроводную воду стерилизуют. На водопроводной воде культуры водорослей развиваются лучше, чем на дистиллированной.

Адаптированную к условиям культуры водоросль выращивают на питательных средах, приготовленных на дистиллированной воде. Дистиллированную воду для питательных сред лучше перегонять в стеклянной посуде, так как металлические дистилляторы загрязняют ее солями тяжелых металлов (цинка, меди), что отрицательно влияет на развитие водорослей.

Приготовление питательной среды - очень важный этап в технике культивирования водорослей. От качества среды в значительной мере будет зависеть характер и интенсивность роста водорослей. При приготовлении питательной среды необходимо соблюдать ряд правил.

1. 
   Для приготовления питательных сред следует использовать реактивы наиболее очищенные. Если таковых нет, их необходимо перекристаллизовывать.
   
2. 
   Реактивы добавлять в питательную среду в той последовательности, в которой они записаны во взятом рецепте.
   
3. 
   Каждую последующую соль добавлять в питательную среду после полного растворения предыдущей.
   
4. 
   Соли железа (железо лимоннокислое) растворяют отдельно в небольшом объеме воды кипячением, затем стерильно приливают в охлажденную стерильную среду.
   
5. 
   В охлажденную стерильную среду вносят также стерильный раствор микроэлементов.
   
6. 
   Чтобы избежать образования осадка в питательной среде после стерилизации, компоненты среды лучше готовить отдельно в небольших объемах воды. Растворы солей нужно стерилизовать и в охлажденном виде стерильно смешивать в необходимом объеме воды.
   
7. 
   Осадок чаще образуется в среде, приготовленной на водопроводной воде, чем на дистиллированной.
   
8. 
   Важное значение для развития водорослей имеют рН среды. Большинство водорослей предпочитают нейтральную или слабощелочную реакцию, равную 7,0 – 7,6. Исключение представляют водоросли дистрофных водоемов и торфяных болот. При приготовлении питательных растворов (после стерилизации)необходимо контролировать рН. Если среда имеет кислую реакцию, то в раствор вносят по каплям щелочь (соду Na₂CO₃ или 25%-ный раствор КОН). Для подкисления раствора употребляют разбавленную серную кислоту.
   
9. 
   Для питательных сред важную роль играет буферность. С целью получения ее в среды вносят KH₂PO₄, Ca(NO₃)₂, CaO, K₂CO_3. Указанные соли принимают участие в забуферивании среды через карбонатное равновесие и непосредственно с помощью входящих в их состав компонентов, например Ca(NO₃)_2. По мере роста водоросли поглощают нитраты и кальций освобождается, принимая участие в забуферивании среды.
   
10. 
    На качество питательной среды и ее пригодность для выращивания водорослей очень влияет стерилизация. Обычно среды стерилизуют в автоклавах сухим паром в течение 45 – 60 мин при давлении 1 атм. Увеличивать продолжительность стерилизации или поднимать уровень давления нельзя, так как это может способствовать образованию в среде значительного осадка из-за образовавшихся комплексов солей.
    

Выбирать оптимальную среду для выращивания того или иного организма удобно на основании использования методов математического планирования эксперимента. Этот же метод очень успешно можно использовать и при определении оптимальных условий культивирования того или иного вида водорослей.

Выделение бактериологически чистых культур водорослей – один из наиболее трудоемких этапов работы. Очистка водорослей от бактерий – сложный и многоэтапный процесс. В осуществлении его четко проявляется специфичность исследуемого организма.

Наиболее трудно поддаются чистке культуры синезеленых водорослей, несколько легче – зеленых. В условиях безбактериального (гнотобиологического) существования водоросли развиваются значительно медленнее, по сравнению с альгологически чистыми культурами, и очень существенно видоизменяются как по морфологическим, так и по физиолого-биохимическим показателям. Это очень затрудняет определение их систематической принадлежности. В связи с этим до начала работы по бактериальной очистке культуры необходимо точно определить систематическое положение организма и тщательно контролировать его развитие на всех этапах получения безбактериальной культуры. Это избавит исследователя от многих ошибок, ибо в процессе бактериологической очистки интересующий исследователя организм может погибнуть, а в культуре начнет развиваться организм-спутник, ранее присутствующий в покоящейся стадии или случайно попавший. Последнее без тщательного микроскопического контроля можно не уловить.

Учитывая значительную специфичность и трудоемкость методов выделения бактериологически чистых культур водорослей, приведем описание многих из них. Выбор метода будет определяться целями и задачами опыта, а также трудностью очистки данного организма.

При работе с бактериологически чистой культурой водорослей, полученной тем или иным методом, периодически необходимо контролировать ее бактериологическую чистоту, поскольку возможность загрязнения очень велика. последнее может произойти как за счет попадания бактерий и нарушения стерильности при пересеве, так и за счет прорастания покоящихся спор бактерий, выживших при стерилизации, что может быть весьма существенным источником бактериального загрязнения культуры.

Очистка водорослей от бактерий ( по Больду)

В стерильные пробирки вносят по 5 мл дистиллированной воды или питательного раствора. Пробирки закрывают пробками и стерилизуют в автоклаве. Одновременно готовят такое же количество пробирок с агаром. Приготовленным на питательной среде с добавлением 0,5-1% глюкозы.

Суспензию культивируемой водоросли стерильной пипеткой или петлей переносят в пробирку со стерильной водой. Пробирку закрывают пробкой, ее содержимое тщательно взбалтывают для получения хорошо взвешенных клеток водорослей. Из этой пробирки, не давая осаждаться взвеси, берут 1 мл и переносят стерильно во вторую пробирку со стерильной водой или питательным раствором. Полученную взвесь хорошо перемешивают и 1 мл взвеси переносят в третью пробирку. Для получения одноклеточной культуры обычно требуется сделать несколько разведений, что определяется чисто технически и в основном зависит от концентрации клеток водорослей в исходном материале.

Х. К. Больд указывает. Что если взять небольшую каплю ярко-зеленой суспензии хлореллы, то ее следует провести через разведения четыре раза. Для посева следует брать только третье или четвертое разведение, так как в первых двух разведениях при высеве на твердую среду главным образом будут расти грибы и бактерии.

Стерильную питательную среду (без посева) из пробирок стерильно переносят в чашки Петри (агаризованную среду перед этим расплавляют на бане при температуре 40-50о С). Водоросли из пробирок последнего разведения высевают на питательный агар, содержащий 0,5-1% глюкозы. После посева чашки переворачивают вверх дном и помещают на свет. На среде питательный агар с глюкозой, водоросли можно обнаружить через пять дней после посева. Так как добавление глюкозы к агару сильно ускоряет рост водорослей. На других средах водоросли начинают расти через две-три недели (дают заметный рост).

Поскольку основная масса бактерий находится в слизи, для ликвидации ее используют посевы водорослей на плотном агаре (4,5-6.0%) против обычного (1,5-2,0%). Для обнаружения выросших на агаре колоний их просматривают под микроскопом. Выросшие колонии или клетки водорослей стерильной петлей переносят на стерильную агаризованную среду в другие чашки Петри. Для этой цели готовят ряд чашек Петри со средами двух видов: агаризованная минеральная среда и агаризованная среда с глюкозой. На нижней поверхности этих чашек по стеклу тушью делают шесть-восемь кружков. Выбранную чистую колонию водорослей петлей переносят на стерильный агар в один из обозначенных кружков. Посевы делают параллельно на обеих средах и повторяют их до тех пор, пока на глюкозе перестанут развиваться бактерии. Очищенную от бактерий культуру водоросли хранят стерильно долгое время.

Для проверки на чистоту культуры рекомендуется делать посевы на стерильной 0,25%-ный мясной бульон: при развитии бактерий бульон резко мутнеет. Одновременно необходимо провести микроскопирование культуры, что помогает обнаружить микроорганизмы-спутники.

Описанный метод дает хорошие результаты, но требует много времени и, кроме того, на агаризованных пластинках преимущественно растут бентосные формы и организмы обрастаний. Планктонные водоросли в большинстве случаев растут слабо.

Для очистки культур водорослей от бактерий часто используют (табл.2) метод химической стерилизации.

Табл.2 Перечень наиболее используемых антисептиков для стерилизации культур водорослей

Антисептик	Концентрация, %
Фенол (карболовая кислота)	0,01	0,05	0,07	0,09	0,1	1,0
Риванол	0,01	0,05	0,07	0,09	0,1	-
Спирт этиловый					1,0	10,0
Детергенты («Деро», «Новость», «Снежинка»)					1,0

Н.С. Гаевская предложила способ стерилизации водорослей с применением риванола и брома. Для этой цели готовят свежий 0,1% раствор риванола на дистиллированной воде. Раствор разбавляют до концентрации 0,5-20 мг/л стерильной питательной средой. На среду с риванолом высевают водоросль. При больших концентрациях риванола водоросль выдерживают 4-5 ч, при маленьких – до трех суток. В последнем случае риванол сменяют несколько раз. Особенно стойкими к нему оказываются протококковые водоросли. На синезеленые он действует губительно, кроме форм со слизистой оболочкой. После применения риванола водоросли необходимо хорошо промыть.

Для стерилизации от бактерий морских диатомовых водорослей рекомендуют использовать йод. Водоросли помещают на 1 – 2 мин в раствор йода, приготовленный из расчета 1 – 2 капли на 50 мл стерильной среды.

Очень часто для стерилизации водорослей используют антибиотики. Например, для очистки культуры хлореллы рекомендуют левомицетин в дозе 1 мг/мл и стрептомицин в дозе 1000 ед/мл культуры водорослей. После четырехчасовой экспозиции культуры стерильны. Комбинация различных доз левомицетина и стрептомицина позволяет снизить экспозицию до 2 ч. Не оказывая токсического действия на хлореллу. Бактериально чистые культуры Asteromonas gracilis и Dunaliella salina получают при выдерживании их в течении суток (с последующим стерильным отмыванием) на минеральной среде с добавлением смеси пенициллина 30 000 + стрептомицина 25 000 ед/мл. при уменьшении концентраций пенициллина и стрептомицина в 10 раз экспозицию увеличивают до 10 суток.

И.В. Максимова и М.Н. Пименова предлагают пользоваться антибиотиками для получения альгологически и бактериологически чистых культур водорослей, а также для подавления сопутствующих бактерий при выращивании культур.

Набор антибиотиков, использованных указанными авторами, приведен в приложении 4. Чувствительность водорослей к антибиотикам изменяется в широких пределах в зависимости от биологических особенностей организмов. Такие антибиотики, как тетрациклин, пенициллин, стрептомицин, эритромицин и нистатин подавляют рост культур хлореллы, сценедесмуса, анкистродесмуса, при концентрациях, отличающихся одна от другой не более, чем в два раза. Для аурантина, колимицина, гриземина эти концентрации отличаются в три-пять раз, в случае же грамицидина С, левомицетина, полимиксина, канцицидина и трихотецина полное подавление роста одних культур происходит при концентрациях в 10-20 раз более высоких.

Концентрации антибиотиков. Не влияющие на рост водорослей, также сильно варьируют в зависимости от культуры. Разница между концентрациями антибиотиков, не влияющими на рост водорослей, и концентрациями, полностью угнетающими их развитие, резко колеблется для разных культур водорослей. Например. Полимиксин в концентрации 5 мкг/мл не влияет на рост Chlorella vulgaris. Полное подавление роста хлореллы происходит при концентрации 25 мкг/мл. Ankistrodermus falcatus не реагирует на добавление полимиксина лишь до концентрации 1 мкг/мл, но незначительный рост может наблюдаться до 50 мкг/мл. Scenedesmus obliquus при 100 мкг/мл полимиксина растет также хорошо, как и в контроле, но увеличение содержания антибиотика в среде всего в 1,5 раза ведет уже к гибели клеток.

Сопоставление альгостатических и альгицидных концентраций антибиотика с его бактериостатическим и бактерицидными концентрациями показало, что концентрации, не оказывающие еще токсического действия на рост водорослей, являются зачастую уже бактериостатическими для ряда микроорганизмов. Альгицидные концентрации для большинства антибиотиков, как правило, всегда выше бактерицидных.

Анализ полученных данных свидетельствует, что альгостатическое и бактерицидное действие антибиотиков может несколько изменяться от состава питательной среды. Это указывает на то, что подбор состава среды может сделать возможным использование более высоких концентраций антибиотиков. Используя антибиотики в комплексе, можно выбрать несколько соединений, которые, взятые вместе, полностью подавят рост микроорганизмов в концентрациях, еще не убивающих водоросли.

Например, аурантин (0,5 мкг/мл) должны полностью подавить рост сопутствующей микрофлоры, почти не влияя на рост хлореллы. Для сценедесмуса можно выбрать пенициллин, грамицидин С и трихотецин, аурантин и колимицин, которые также должны подавить рост сопутствующей микрофлоры. При очистке анкистродесмуса можно использовать аурантин и колимицин. При выращивании хлореллы для подавления сопутствующей микрофлоры могут быть использованы левомицетин и колимицин (для подавления грамотрицательных бактерий – основной сопутствующей микрофлоры водорослей), аурантин (для подавления грамположительных бактерий) и нистатин (для подавления грибов). Эти антибиотики должны полностью подавить рост испытанных микроорганизмов, не влияя на темп размножения хлореллы. Для подавления микроорганизмов в растущей культуре сценедесмуса можно использовать пенициллин, аурантин, стрептомицин, колимицин и полимиксин, добавление которых приводит к отмиранию бактерий, не изменяя темпа роста водорослей. При культивировании анкистродесмуса интерес представляют пенициллин, аурантин, колимицин.

Антибиотики могут с успехом использоваться и для получения альгологически чистых культур водорослей при выделении из из естественных мест обитаний. Например, для получения альгологически чистой культуры сценедесмуса может быть использован полимиксин. В конуентрации 50 мкг/мл он вызывает полную гибель клеток хлореллы и анкистродесмуса, а сценедесмус не снижает темпа размножения при 100 мкг/мл. для очистки хлореллы удобно пользоваться стрептомицином, левомицетином, колимицином, нистатином, трихотецином. Концентрации этих антибиотиков, альгицидные для сценедесмуса и анкистродесмуса, еще не убивают клеток хлореллы. Для получения альгологически чистой культуры анкистродесмуса удобен эритромицин, так как эта водоросль выдерживает концентрации в 1,5 раза более высокие, чем хлорелла и сценедесмус.

Сказанное выше указывает на то, что альгологическую и бактериологическую очистку водорослей можно вести одновременно.

Для химической очистки водорослей от бактерий используют и другие реагенты.

Например, И.В. Боуман для очистки культур эвглены и хламидомоноса от бактерий и грибов использует кофеин в концентрации 0,01-0,03 М на солевой среде.

Широкое распространение за рубежом для очистки водорослей от сопутствующих бактерий получил актидион (C15H23O5 N). Молекулярный вес – 297,39. этот антибиотик успешно используют для очистки от бактерий культур зеленых, синезеленых и диатомовых водорослей.

Следовательно, использование различных антибиотиков для химической стерилизации водорослей необходимо отнести к числу наиболее перспективных и заслуживающих внимания. Однако необходимо иметь в виду, что чувствительность водорослей к антибиотикам изменяется в широких пределах в зависимости от выбранной культуры, а степень действия антибиотиков зависит от состава среды и условий выращивания. В связи с этим выбор антибиотиков и их рабочая концентрация индивидуальны для различных водорослей.

Принимая во внимание сведения, приведенные в табл.2 и приложении 4, альгологическую и бактериологическую очистку водорослей можно вести одновременно., тем более, что всегда можно выбрать несколько соединений, которые, взятые вместе, могут полностью подавить рост микроорганизмов в концентрациях, еще не убивающих водоросли при использовании их в отдельности.

50мл суспензии водорослей обрабатывают двумя каплями детергента. Затем встряхивают с 1%-ным фенолом в соотношении одна часть суспензии на четыре части раствора фенола. Полученную смесь центрифугируют после центрифугирования выпавшие в осадок клетки водорослей промывают дистиллированной водой (стерильной). Затем водоросли помещают на агаровые пластинки (2% агара + 0,5% глюкозы на питательной среде) для отрастания. Выросшие колонии несколько раз пересевают, пока не убедятся в их бактериальной чистоте. Метод можно использовать для зеленых и синезеленых водорослей.

Очистить культуру водорослей от бактерий можно подбором питательной среды, обеспечивающей одновременное развитие водорослей и бактерий, чтобы установить видимые очаги развития последних. Трудность подбора такой среды заключается в подыскании условий, обеспечивающих оптимальный рост водорослей и задерживающих, но не исключающих совсем, рост бактерий. Сопровождающие водоросль слизистые бактерии неплохо растут на сусловых средах, если в последние разбавлены минеральным раствором. Наилучшими концентрациями сусла для зеленых и диатомовых водорослей являются разбавления в 50-100 раз. Оптимальными для синезеленых являются разбавления значительно больше - 200-300 раз. Применение подобных сред с 5-6%-ным содержанием агара позволяет в довольно короткий срок (3 месяца) выделить чистые культуры зеленых водорослей.

Пари выделении чистых культур зеленых водорослей проводят посев на чашки Петри с указанной питательной средой суспензии исследуемых организмов. Одну каплю взвеси водорослей на жидкой культивационной среде стерильной петлей наносят на середину чашки Петри и тщательно размазывают ее по поверхности агаровой пластинки. Изолированные колонии бактерий обычно появляются на второй день. Рост водорослей начинается значительно позднее – через неделю, две. Отыскав с помощью лупы свободные от бактерии колонии водорослей, переносят их платиновой иглой в пробирки с жидкой и твердой минеральной средой, одновременно производя проверку на чистоту культуры с помощью высевов на мясо-пептонный бульон из той же колонии водорослей. Удачно выбранные колонии при первом же пересеве могут дать бактериологически чистые культуры.

Получение бактериологически чистых культур синезеленых водорослей (по Гусеву, Телитченко, Федорову)

Наиболее трудно поддаются бактериальной очистке культуры синезеленых водорослей. Сложность бактериальной очистки зеленых, диатомовых и, особенно синезеленых, объясняется наличием неспороносных, слизеобразующих бактерий, оболочка которых обладает способностью крепко прилипать к оболочке водорослей. Сочетание бактерий с синезелеными водорослями также образующими слизь, объясняет особенную трудность очистки данного вида водорослей. В связи с этим использование антисептиков и антибиотиков, ультрафиолетовое облучение культур ртутно-кварцевыми лампами весьма результативны в отношении случайных бактериальных загрязнений, оказываются неэффективными по отношению к слизевым формам бактерий, так как последние от неблагоприятных воздействий хорошо защищены слизью, окружающей клетки водорослей.

Очень важно для очистки культур синезеленых водорослей от бактерий получить свободные от слизи гормогонии или обрывки нитей, а затем уже обрабатывать их различными антибактериальными агентами.

С этой целью культуру водорослей на жидкой среде фильтруют под вакуумом через стеклянные фильтры №1 и №2. через поры фильтров проходят только гормогонии, споры и короткие обрывки нитей, большинство которых свободно от слизи. Таким образом, удается получить суспензию, содержащую бесслизевые короткие нити и гормогонии, дальнейшую стерилизацию которых можно производить с помощью известных химических методов.

Наиболее благоприятные результаты стерилизации получают при 5-7 минутном прогревании культур в кипящей воде, при обработке суспензий водорослей смесью стрептомицина и пенициллина (по 50 000 ед/мл) и при 10-минутном облучении бесслизевых культур ультрафиолетовым светом ртутно-кварцевой лампы в кварцевых чашечках (расстояние от источника облучения 30 см).

Для проверки чистоты полученных культур можно рекомендовать высевы из жидких культур водорослей на ряд контрольных сред. В качестве последних используют: исходную минеральную среду для культивирования синезеленых водорослей + 0,5 % глюкозы; исходную среду +1% сусла; МПА; МПБ; среду Эшби для азотобактера; среду Виноградского для нитрифицирующих бактерий; среду Хатчинсона для целлюлозных бактерий; среду Ларсена для фотосинтезирующих бактерий.

Отсутствие бактериального роста на перечисленных средах и микроскопический контроль однородности культур водорослей дают возможность контролировать бактериологическую чистоту культуры и делают ее пригодной для сравнительно-физиологических и биохимических работ.

Получение бактериологически чистых культур синезеленых водорослей (по Михайловой)

Для получения чистых культур осциллаторий и формидиумов водоросли отсевают через 6-12-24 ч с момента помещения их в термостат. На последних этапах работы отсев осуществляют через 1-2 ч. Для посева берут участки нитей, наиболее удаленные от центра посева.

Использование пептонной среды с 2% агара дает больший процент стерильных клеток, чем выращивание на минеральной среде.

Очистка водорослей от бактерий с помощью ультрафиолетового облучения и ультразвука

Для избавления от бактерий используют стерилизующие действия ультрафиолетовых лучей. Культуру водорослей на кварцевых стеклах и чашечках облучают на 10-20 мин ультрафиолетовыми лучами. Источником последних могут быть бактерицидные лампы БУВ-20, БУВ-40, ПРК-10. расстояние культуры от источника облучения – 20-30 см. после облучения водоросли высевают на агар и контролируют их бактериальную чистоту указанными ранее методами.

При работе с ртутно-кварцевыми лампами (источниками ультрафиолетового облучения) необходимо соблюдать особую осторожность: работать в темных очках, защищать от действия лучей открытые участки кожи (во избежание ожога), не находиться в боксе в момент облучения (лампы озонируют воздух).

Под влиянием ультрафиолетового облучения возможно образование мутантов.

Из физических методов стерилизации используют также обработку ультразвуком при напряжении 5 кv в течение 5-30 мин.

Очистка синезеленых водорослей от сопутствующих бактерий с помощью природных антисептиков (по Горюновой, Одоевской, Герасименко)

Для очистки культур синезеленых водорослей от сопутствующих бактерий применяют водные экстракты ягод клюквы и брусники. Как известно, эти ягоды обладают удивительно высокой устойчивостью против микроорганизмов, благодаря чему способны к хранению в течение длительного времени, не подвергаясь разложению.

Техника приготовления экстрактов клюквы и брусники заключается в следующем. Навеску ягод (влажность 86-89%) растирают в ступке. К полученной кашице добавляют дистиллированную воду с таким расчетом, чтобы получить 5%-ный раствор, в расчете на сухой вес после фильтрации через бумажные фильтры на воронках Гуча. Из маточного раствора готовят различные разведения добавлением соответствующих количеств к питательной среде, используемой для выращивания синезеленых водорослей. Содержание экстракта в среде составляет 0,5; 0,1; 0,05 и 0,01%. Экстракты добавляют к предварительно простерилизованной среде без стерилизации. После инокуляции водорослями питательную среду с экстрактами ягод периодически проверяют на зараженность бактериями посевами на МПА. Сусло, среду Эшби и среду, содержащую глюкозу.

Посевы водорослей в обычную жидкую минеральную среду и в среды с экстрактами ягод чередуют. Пересевы на свежие среды проводятся через 10-15 дней. После третьего пересева удается получить бактериологически чистую культуру.

Примененный прием имеет свои сезонные ограничения и, кроме того, требует наличия свежего материала. Что не всегда можно осуществить. Более доступны для изготовления бактерицидных вытяжек ягоды клюквы, они же и действуют сильнее, чем ягоды брусники. Однако значительное содержание в них экстрактивных веществ, задерживающих фильтрацию, очень затрудняет их применение. В ряде случаев метод будет требовать определенной доработки.
МЕТОДЫ ПОДДЕРЖАНИЯ И СОХРАНЕНИЯ ВОДОРОСЛЕЙ В КОЛЛЕКЦИИ.