Посев и выращивание водорослей на жидкой среде

Выращивание водорослей на агаризованных средах

В технике лабораторного выращивания водорослей агаризованную среду используют для выделения чистых культур, хранения музейных культур водорослей, а также для обрастающих форм. Иногда для специальных задач эксперимента (проверки действия вирусов, бактерий, фитонцидных веществ и др.) проводят агаризацию хорошо развившейся суспензии водоросли. Для этого суспензию разливают тонким слоем по чашкам Петри, а сверху добавляют теплый раствор агара такой концентрации, чтобы в общем разведении она находилась в пределах 1,5- 2,0 %(исходный раствор агара 3- 4%). При застывании агара в чашке Петри образуется ровная зеленая поверхность, на которой хорошо видны зоны отмирания клеток водоросли под действием того или иного фактора (образование хлорозных пятен, отличающихся от общего зеленого фона белесо-желтоватым цветом).

Посев водоросли на агаризованную среду обычно проводят с помощью микробиологической петли (платиновой или стальной). Посевной материал чаще всего распределяется штрихом, реже уколом.

На агаризованных средах водоросли растут медленнее, по сравнению с жидкими. В связи с этим агаризованные среды используют для выращивания водорослей в музее. С этой целью для музейных культур синезеленых водорослей агаризуют среду Громова, для зеленых- Майерса. Чтобы агаризованная среда с посевом не подсыхала, пробирки или колбы после посева плотно закрывают ватно-марлевыми пробками и покрывают колпачками из полиэтилена, затем культуру помещают на некоторое время (1-1,5 недели) на свет для нарастания числа клеток.

Удобным для такого выращивания является обычный медицинский шкаф с закрепленными снаружи по его боковым стенкам лампами дневного света. Иногда лампы располагают внутри шкафа (под стеклянными полками). Это способствует лучшему освещению культур, но и повышает температуру внутри шкафа, что не всегда допустимо, особенно при длительном выдерживании в таких условиях пробирок или колб с водорослями (высыхание агара, перегрев и др.)

Длительное хранение музейных культур проводят либо в таких шкафах при температуре не выше 48-20^оС, либо в холодильнике с температурой 6-10 ^о С и постоянным слабым освещением 300-500 лк от 15 – 25-ватной лампы накаливания или люминесцентной лампы.

В таких условиях культура может сохраняться неопределенно долгое время и требует лишь редких (через2-3 месяца) пересевов в случае подсыхания агар-агара. Для этой цели удобнее использовать большие пробирки и специальные подставки для них. Музейные культуры следует пересевать с особой тщательностью и с соблюдением полной стерильности (в специальных стерильных боксах и над пламенем). Пересеянные пробирки сразу же закрывают пробками, полиэтиленовыми колпачками. На них тушью пишут номер культуры, дату посева и число предыдущего посева, с которого была пересеяна культура. Регистрируют музейные культуры в специальном журнале. Ниже приводим пример документации (табл.1).

Таблица1.Образец регистрационной записи музейных культур водорослей

На агаризованных средах культуры водорослей можно пересылать и перевозить, а также передавать в другие коллекции.

Из органических сред наибольшего внимания заслуживает почвенный экстракт. Среды, приготовленные с его использованием, обладают хорошей буферностью по отношению к железу и содержат микроэлементы. Прибавление почвенного экстракта к питательным средам приближает их к природной воде и благоприятно действует на развитие водорослей. Естественно, эти среды не пригодны для физиологических опытов по питанию водорослей.

Существует несколько способов приготовления почвенных экстрактов.
Способы Прингсхейма

1. 
   1 кг садовой земли(гумусовая или из хорошо перегнивших листьев) кипятят 1 ч в 1 л водопроводной воды. Настой оставляют на двое суток и затем сливают. При употреблении настой разбавляют шестью частями дистиллированной воды и на 1 л жидкости вносят 1,5 г KNO₃ или же на 100 мл питательного раствора вносят 5-10 мл почвенного экстракта. Перед употреблением раствор необходимо стерилизовать.
   
2. 
   Садовую землю заливают двойным объемом воды и оставляют на несколько дней. Перед употреблением разводят в отношении 1 : 10 или 1 : 50 и нагревают 5 мин в автоклаве.
   

K₂PO₄-0,2 г и Ca (NO₃)₂ – 0,2 г.

Для водорослей, требующих повышенных доз железа, хорошие результаты дает прибавление илов. Иловые отложения, взятые со дна водоема, стерилизуют с небольшим количеством воды в колбочках и по мере надобности пипеткой вносят на дно колбочек с минеральной средой по 1-2 мл на 50 мл среды.

Для культур водорослей, собранных с торфяных болот, а также водорослей, живущих в водоемах с кислой реакцией среды (рН<7,0<7,0), бедных солями кальция, рекомендуется употреблять раствор Веттштейна. Он состоит из двух частей.

При приготовлении раствора части А и В смешивают в равных количествах.

Кроме указанных выше экстрактов, к минеральным питательным средам для выращивания водорослей иногда прибавляют такие органические соединения, как глюкоза, сахароза, аминокислоты, физиологически активные соединения. Добавление этих веществ в среду стимулирует рост и размножение водорослей, однако оказывает значительное влияние и на сопутствующую микрофлору. Под влиянием добавляемых органических соединений существенно усиливается рост микроорганизмов, имеющихся в альгологически чистой культуре – бактерий, грибов. Это делает культуру водорослей непригодной для проведения физиолого–биохимических экспериментов.

Добавление органических веществ в среду для решения ряда физиолого-биохимических вопросов следует проводить только при наличии бактериально чистой культуры водорослей.

Для получения сравнимых результатов в опытах с микроорганизмами большое значение имеет однородность посевного материала. Поскольку техника получения синхронных культур водорослей разработана недостаточно и синхронизированы в большинстве случаев лишь культуры хлореллы, особого внимания заслуживают приемы приготовления инокулята.

Обычно инокулят для посева готовят одним из методов, выбор которого зависит от целей опыта, характера роста культуры, степени ее адаптации к конкретным условиям выращивания

Как известно, культуры водорослей сохраняют на агаризованных средах. Из культуры, растущей на агаризованной среде, практически невозможно непосредственно приготовить гомогенный инокулят. В связи с этим культуру водоросли из агаризованной среды сначала переводят на жидкую среду, используя для этого обычные микробиологические методы посева. Организмы выращивают на жидкой среде в течение 5 – 20 дней (можно и больше) в зависимости от темпа роста. Из полученной жидкой культуры готовят посевной инокулят для опыта одним из указанных ниже способов.

Если водоросль растет комками (например, Tolypothrix, Anabaena и др.) или постепенно (формы обрастания), для получения более или менее гомогенного инокулята культуру гомогенизируют 2 –3 мин в гомогенизаторе. При гомогенизации трихомы распадаются на отдельные клетки, что дает возможность тщательно перемешать исходный инокулят и получить более или менее выравненный посевной материал.

Вместо гомогенизаторов с металлическими ножами для размельчения комков водорослей лучше использовать шуттель-аппараты и стеклянные бусы. В этом случае 5 – 20-суточную культуру помещают в колбу на 1 л и встряхивают на шуттель-аппарате со стеклянными бусами (3,5 х 7,0 мм) в течение 10 мин.

Для выравнивания инокулята после измельчения применяют фильтрование. С этой целью полученную суспензию с размерами клеток не менее 4 – 7 фильтруют в стерильных условиях через обычный бумажный фильтр (синяя лента).

Для фильтрования также применяют фильтры Шотта (№ 1 – 4) или Нуча (№ 1). Эти фильтры пропускают отдельные клетки и короткие нити. Отфильтрованную культуру используют для опытных посевов.

Фракционировать клетки водорослей в суспензиях можно также с помощью центрифугирования. В этом случае для посева используют отдельные фракции клеток, осажденных из среды при определенных ускорениях.

Для ориентации приводим материалы по переводу числа оборотов в минуту при центрифугировании в ускорения (g);

Об/мин	g
3000	704
4000	1360
5000	1950
6000	2800
7000	3800

После получения отдельных колоний водоросли стерильной петлей (аналогично обычному микробиологическому пересеву) переносят с чашек в стерильную колбочку с жидкой средой, или в пробирку со скошенным ага ром. Более правильным с точки зрения сохранения активности культуры и более удобным является метод сохранения культур водорослей в виде штриха на косом агаре. После посева колбы в пробирку помещаются для некоторого нарастания числа клеток на 1 – 1,5 недели на свет.

Удобным для такого выращивания является обычный медицинский хирургический шкаф с закрепленными под каждой стеклянной полкой лампами. (рис 1 - 2).

При этом приборки лучше помещать в кристаллизатор, неплотно прикрыты стеклом; на дно кристаллизатора или в стаканчик наливают воду для создания влажной атмосферы, способствующей лучшему росту водорослей и предотвращающей высыхание агара (рис 3). Культуру, выращиваемую в колбе, следует время от времени встряхивать. После того как водоросли достаточно хорошо разовьются, что заметно по позеленению жидкости или четкому зеленому штриху на агаре, колбы и пробирки переносят в холодильник с температурой 6 – 10⁰, с постоянным слабым освещением 300 – 500 люкс от 15 вт лампы накаливания или от люминесцентной лампы. В таких условиях культура может сохраняться неопределенно долгое время и требует лишь редких (через 1,5 – 2 месяца) пересевов в случае подсыпания агар-агара. Пример таких холодильников-музеев приведен на рис 4 и 5.

При массовой работе по выделению активных форм водорослей для предварительного сравнения и отбора культур могут быть использованы наиболее простые методы сравнения культур как по скорости роста колоний на агаре, так и по скорости роста в колбах на жидкой среде.

Первый метод предложен недавно К. В. Квитко (20) и состоит в том, что при высеве слабой суспензии водорослей на стандартную агаризованную среду по мере роста колоний проводят измерение диаметра колоний при помощи винтового окуляр-микрометра. Культуры, обладающие наибольшей скоростью увеличения диаметра колонии, отбираются как наиболее активные.

Второй способ состоит в высеве изучаемых форм водорослей на выбранную для испытаний жидкую среду при условии одинокого количества посевного материала в среде. После выдерживания таких колб с культурами одинаковое время в одинаковых условиях, аналогичных описанным в главе II и на рис 1 – 2, сравнивают скорость роста испытываемых форм или по числу клеток, или по биомассе (см приложение III и IV), или по интенсивности позеленения суспензий.

Однако указанные методы могут быть рекомендованы как весьма условные и при-менимые лишь в случае большого количества испытываемых образцов для предварительного отбора. Необходимо иметь в виду, что оба указанных метода выращивания водорослей, так же как выращивание в колбах на качалке, не создают условий для интенсивного роста куль-туры, когда число клеток водорослей за короткий срок достигает значительной плотности. Результаты сравнения культур в условиях неактивного их развития могут оказаться прямо противоположными полученным при сравнении культур в условиях интенсифицирующих их роста (15). Поэтому все испытания по отбору высокоактивных светолюбивых, термо-фильных, фотоавтотрофных форм водорослей следует проводить в условия интенсивной культуры (25).

ИНТЕНСИВНАЯ КУЛЬТУРА ВОДОРОСЛЕЙ, ОСНОВНОЕ ОБОРУДОВАНИЕ, ПОДГОТОВКА И ПОСТАНОВКА ОПЫТОВ.

Одним из наиболее простых методов интенсификации развития водорослей, приб-лижающих такую культуру к условиям массовой культуры, является выращивание их в сосудах с постоянной продувкой воздухом, обогащенным углекислотой, на среде с высокой концентрацией минеральных питательных солей, при круглосуточном освещении культуры достаточно интенсивным источником света, при постоянным перемешивании суспензии.

Создание указанных условий может быть обеспечено установкой для выращивания водорослей, имеющей принципиальную схему, представленную на рис 6.

Подготовка и постановка опыта.

Подготовка посуды и среды. Все первичные испытания следует вести в стерильных условиях. Для этого поводят стерилизацию сосудов, гребенок, ватного фильтра и увлажнителя в автоклаве при 1 атм¹.

Во избежание растрескивания не рекомендуется загружать сосуды для стерилизации в горячий автоклав.

Каждый опыт следует ставить не менее чем в двух повторностях при использовании больших сосудов (емкостью 250 мл) и не мене чем в трех повторностях при работе с малыми культуральными сосудами (емкостью 30 мл).

Питательную среду стерилизуют отдельно от сосудов в колбах. В каждую колбу заливают столько среды, сколько необходимо в опыте для одной культуры. Так, если проводится сравнение роста трех культур и при этом используются большие сосуды с двумя повторностями опыта, то необходимо приготовить три колбы по 500 мл среды в каждой.

Подготовка культуры. За несколько дней перед постановкой опыта водоросли пересевают с косяка или с жидкой среды, на которых культура сохранялась, колбы со свежеприготовленной питательной средой того же состава, которой будет в дальнейшем использоваться в опыте. В опытах по сравнению различных культур подготовительный высев проводят для всех форм в один и тот же день и приблизительно одинаковым по числу клеток или по биомассе количеством водорослей. Колбочки ставят на четыре – шесть дней на свет для подращивания. (рис 2).

Постановка опыта. При постановке опыта, соблюдая правила стерильности, вносят колбы со стерильной средой одинаковое по числу клеток или по биомассе количество водо-рослей. Суспензию тщательно взбалтывают и разливают по сосудам, при этом необходимо следить, чтобы горло колбы не было слишком близко к огню во избежание трещин на колбе перегрева суспензии.

После того как суспензия разлита по сосудам, последние присоединяют к гребенке, для чего из каждого резинового отвода гребенки вынимают вату, конец трубки смазывают 90⁰ спиртом или стерильной водой (или стерильным глицерином)и одевают на трубку барботера соответствующего сосуда, при этом вату из трубки барботера можно не вынимать. Общий отвод гребенки присоединяют к короткой трубке увлажнителя, а последний через трубку, доходящую до дна^*, с ватным фильтром, так что собранная система в общем виде выглядит так, как это представлено на рис 6.

Сосуды в лапках или кольцах помещают перед источником света, свободный конец ватного фильтра подсоединяется (уже не стерильно) к реометру, через который на гребенку подается воздух, обогащенный углекислотой. Смеси воздуха с СО₂ должно поступать в сосуды такое количество, чтобы через каждый большой сосуд (200 мл) продувалось приблизительно 10-15 л воздуха в час.

В связи с тем, что точная градуировка подачи воздуха на каждый сосуд осложняет постановку опыта, ставят один реометр на гребенку, а равномерность прохождения воздуха через каждый сосуд регулируют винтовым зажимом, одетый на шланг, соединяющий сосуд с гребенкой.

По ходу опыта необходимо следить, чтобы в гребенкке не скапливалось большое количество влаги, так как в этом случае может произойти намокание ваты в месте соединения сосуда с гребенкой, и воздух через сосуд продуваться не будет.

Взятие проб по ходу опыта из малых сосудов осуществляется стерильной пипеткой через горло сосуда. Вата, находящаяся в отводе сосуда в месте соединения его с гребенкой, позволяет временно отключить сосуд и производить взятие пробы в случае надобности в полностью стерильных условиях. Взятие проб из больших сосудов облегчается наличием внизу сливного крана, при этом следует первую порцию взятой суспензии слить и для анализов использовать вторую порцию. Носики кранов после взятия пробы следует прочищать ватой.

Учет числа клеток в счетной камере. Для подсчета числа клеток в суспензии водорослей могут быть использованы любые камеры, предназначенный для подсчета форменных элементов крови (камера Тома, Горяева, Бюркера и др.) или планктона (камера Нажотта и др.).

Дальнейшее описание проводится для камеры Горяева. Камера представляет собой стеклянную пластинку(рис 18, а) с отделенной при помощи поперечных желобков средней частью. Высота средней части на 0,1 мм ниже, чем для всей пластинки, благодаря чему при накрывании покровным стеклом в центре пластинки создается камера. (рис 18, б).

На поверхности средней части пластинки нанесена сетка (рис 18, в) с известной площадью квадратов. Капля культуры наносится на сетку и прикрывается покровным стеклом. Покровное стекло тщательной протирают (для лучшего протирания на боковые поверхности стеклянной поверхности наносят небольшие капли суспензии). После протирания всю лишнюю жидкость вокруг покровного стекла и в желобках осторожно удаляют при помощи кусочка фильтровальной бумаги или марли. Под микроскопом подсчитывают в определенном числе квадратов количество клеток водорослей и затем, зная площадь поверхности и высоту камеры, делают пересчет числа клеток на 1 мл суспензии (см ниже расчет).

При подсчете числа клеток в большинстве случае бывает необходимо развести суспензию в 50, 100, 250 и т.д. раз, чтобы в камере вести подсчет при плотности клеток 1,0 – 2.0  10⁶/см³. Подсчет числа клеток непосредственно в плотных суспензиях дает меньшую плотность и более трудоемок.

При подсчете в камере следует избегать следующих ошибок.

1. 
   После взятия суспензии в пипетку необходимо очень быстро нанести каплю на поверхность сетки, пока клетки не успели осесть в нижней части пипетки.
   
2. 
   После нанесения на поверхность сетки каплю следует быстро накрыть покровным стеклышком и притереть его во избежание оседания клеток из капли, большей по объему, чем объем капли в камере после притирания стекла.
   
3. 
   После притирания покровного стекла и пи подсчете под микроскопом необходимо следить, чтобы жидкость под покровным стеклом было распределена равномерно, без стягивания капли при подсыхании.
   
4. 
   После подсчета камеру следует сразу же тщательно вымыть и притереть мягкой фланелью.
   
5. 
   Для точного подсчета необходимо просчитывать большое количество квадратов (лучше всю сетку) и обязательно проводить повторные просчеты нескольких капель той же суспензии. Многие камеры сделаны с двумя стеклами, разделенный желобком. В таких камерах можно сразу наносить и просчитывать две капли, при этом следует обратить внимание на то, чтобы капли наносились не подряд из одной и той же пробы в пипетке, а при двукратном взятии суспензии в пипетку.
   

Так как пересчет ведется на количество клеток в 1 см³ суспензии, то выражаем найденный объем в см³