Составляющие элементы днк-микрочипа
Применение ДНК-микрочипов
жүктеу/скачать 35,47 Kb.
|
ДНК-микрочипы
| 1.9 Применение ДНК-микрочипов
Области применения ДНК-микрочипов включают в себя анализ экспрессии генов - это преобладающее применение ДНК-микрочипов. РНК, выделенная из культуры клеток, подвергается обратной транскрипции, в результате которой получается меченная кДНК. Иногда требуется ещё один этап траскрипции с кДНК (для чипов, работающих с РНК). Тогда получается меченная кРНК. Существует несколько различных способов внести в целевую молекулу различные метки: включение флуоресцентно меченных нуклеотидов в процессе синтеза кДНК или кРНК, использование биотин-модифицированных нуклеотидов, которые потом окрашиваются флуоресцентно-меченным стрептавидином, использование во время синтеза модифицированных нуклеотидов, на которые затем можно добавить флуоресцентную метку. Меченная таким образом ДНК или РНК гибридизуется на микрочипе, после чего смывается. В каждой точке чипа детектируется флуоресцентный сигнал. В случае с биотинилированными образцами ДНК-микрочип после гибридизации окрашивается стрептавидином, содержащим флуоресцентые метки. Флуоресценция возбуждается светом лазера и регистрируется, как правило, на сканирующем конфокальном микроскопе. Следующая область применения - анализ связывания транскрипционных факторов. Микрочипы также используются вместе с иммунопреципитацией хроматина для определения сайтов связывания транскрипционных факторов (ТФ). В экстракт клеточной ДНК добавляют формальдегид, что ведет к образованию ковалентных сшивок между ДНК и белками. После чего ДНК фрагментируется. Необходимый ТФ выделяется из смеси при помощи аффинной хроматографии с использованием антител или тэгов, которые вставляются в данный ТФ генно-инженерными методами заранее. После очистки ДНК освобождается от ТФ, амплифицируется, флуоресцентно метится и используется для гибридизации на микрочипе. Такая техника широко известна как «ChIP-chip», или иммунопреципитация хроматина на микрочипе. Но у такой техники есть свои ограничения в связи с тем, что ТФ могут связываться далеко от регулируемого ими гена. Ещё одно применение микрочипов - генотипирование. ДНК-микрочипы широко используются для выявления однонуклеотидных полиморфизмов(SNP). Существует несколько различных подходов: аллельная дискриминация На микрочипах располагаются короткие зонды, содержащие все варианты SNP в центре, так как эта позиция наиболее сильно влияет на качество гибридизации. Фрагментированная, амплифицированная, флуоресцентно-меченная ДНК образца наносится на микрочип, где происходит гибридизация образца и зонда. Лучший сигнал будет возникать там, где имела место полная комплементарность молекул. «Golden Gate» анализ В основе этого метода лежит полимеразная цепная реакция. В раствор геномной ДНК помещаются молекулы комплементарные геномной ДНК и на 3'-конце содержащие различные модификации SNP, а на 5'-конце различные праймеры для последующего проведения ПЦР, кроме того добавляется и комплементарная молекула с другой стороны от SNP, содержащая на 5'-конце ещё один праймер для ПЦР. Полимераза будет осуществлять синтез только с того праймера, 3'-конец которого соответствует SNP. В итоге в зависимости от того, с какого праймера с видоизмененным 3'-концом будет идти ПЦР, такой SNP и наблюдается в образце. Расширение праймеров Здесь зонды подобраны так, что покрывают весь участок ДНК прямо до SNP, не включая полиморфизм. Фрагментированная геномная ДНК гибридизуется с таким чипом, после чего в раствор добавляется полимераза и флуоресцентно-меченные нуклеотиды с 4 различными метками на 3'-конце. Подобные нуклеотиды могут присоединиться полимеразой к имеющейся цепи, но потом присоединить к себе следующий нуклеотид не могут. В итоге зонды расширяются на один нуклеотид, который и соответствует SNP. Оценка крайнего нуклеотида Этот метод очень схож с методом расширения праймеров. Единственное отличие заключается в том, что зонды располагаются не на плоской подложке, а на множестве мелких шариков. SNP также распознается по цвету метки единственного достроенного нуклеотида. Технология ДНК-микрочипов находит самые разнообразные применения в современной биологии и медицине для анализа сложных смесей ДНК — например, совокупности всех транскриптов (матричных РНК) в клетке. ДНК микрочипы используют для анализа изменения экспрессии генов, выявления однонуклеотидных полиморфизмов2, генотипирования3 или повторного секвенирования4 мутантных геномов. Микрочипы отличаются по конструкции, особенностям работы, точности, эффективности и стоимости. Использование технологий микроэлементов генетического кода позволяет оценить состояние и идентификацию генов живого организма. С помощью чипов возможно безраздельное и комплексное исследование биологического организма. [1. http://www.machinelearning.ru/wiki/index.php?title=ДНК-микрочип] [2. https://ru.wikipedia.org/wiki/ДНК-микрочип] 1 Экспрессия генов - процесс, в ходе которого наследственная информация от гена (последовательности нуклеотидов ДНК) преобразуется в функциональный продукт — РНК или белок. 2 Однонуклеотидный полиморфизм — отличия последовательности ДНК размером в один нуклеотид в геноме представителей одного вида или между гомологичными участками гомологичных хромосом. 3 Генотипирование — это процесс определения различий в генотипе человека путем исследования последовательности ДНК и сравнения ее с другими последовательностями. 4 Секвенирование биополимеров (белков и нуклеиновых кислот — ДНК и РНК) — определение их аминокислотной или нуклеотидной последовательности. В результате секвенирования получают формальное описание первичной структуры линейной макромолекулы в виде последовательности мономеров в текстовом виде. жүктеу/скачать 35,47 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|