15-ші тақырып Агглютинация реакциясы. Тура емес гемагглютинация реакциясы. Сабақтың мақсаты

Бұл реакцияда ферменттермен (Ф) таңбаланған антиденелерді немесе антигендерді пайдаланады. Бұндай антиденелер (антигендер) антигендермен (антиденелермен) әрекет етуге қабылеттілігін, ал фермент – өзіне сәйкес субстратпен өзара әрекеттесу қасиетін сақтайды. Фермент ретінде - пероксидазаны және сілтілі фосфотазаны жиі пайдаланады. Антидене мен фермент қосындысын (комплексін) – конъюгат деп атайды. АГ+АТ+Ф комплексін анықтау үшін оған субстрат қосады. Субстрат – хромогеннің түсінің өзгеруін қамтамасыз ететін зат. Пероксидаза үшін субстрат болып сутек асқын тотығы, хромоген болып 5-аминосалицил қышқылы, ортофенилендиамин және т.б. есептеледі. Пероксидаза асқын тотықты бұзады, соның нәтижесінде хромогенді тотықтыратын белсенді оттегі түзіледі . Нәтижесінде - ортофенилендиамин сары түске, аминосалицил қышқылы - қоңыр түске боялады.

ИФТ антигендер немесе антиденелерді in vitro және in situ (ағзаның кесіндісінде) табуға қолданады.

ИФТ-нің екі түрі бар, ол: гомогенді ИФТ , яғни реакция компоненттері бөлінбеген, бір тектес (EMIT – enzyme multi plied immunoassey technique) және гетерогенді ИФТ, реакция компоненттері әртүрлі, әр тектес.
Гомогенді ИФТ. Бұл вариантында, реакция толығымен компоненттердің бірыңғай қоспасында пробиркада өтеді. Ветеринариялық практикада, мысалы, гомогенді ИФТ микотоксиндерді, биологиялық сұйықтықтардағы емдік заттарды анықтауға пайдаланады. Бұл ретте, ферментпен тамғаланған (АГ-Ф) , ізделіп отырған антигенге үйлес, стандартты антигенді қолданады. АГ-Ф –нің антиденемен байланысуы ферменттің белсенділігінің төмендеуіне әкеледі. Егер материалда ізделіп отырған антиген болса, онда ол тест-жүйедегі гомологты антиденелермен байланысады. Нәтижесінде, АГ-Ф айтарлықтай саны АД байланыссыз қалады. Ол , субстраттың қатысуымен түсті реакцияның үдеуін (позитивті реакция) тудырады. Зерттелініп отырған материалда ізделінген антиген (АГ) болмаса онда біріншіге кері нәтиже- (түссіз) болады, яғни реакция – теріс. ИФТ-ның бұл вариантына тест-жүйені құрамында керекті реагенттері бар ұнтақ күйінде шығарады. Реакцияның нәтижесін визуальды немесе инструментальды жолмен есепке алады.

Гетерогенді (қаттыфазалық) ИФТ. Реакцияның бұл вариантының мынадай синонимдері бар: ИФТ-бөлшектенген компоненттерімен; ИТФ-қаттыфазалық (ҚИФТ); ферментке тәуелді иммуносорбентті талдау (ағыл.: enzyme-linked immunosorbent assay – ELISA).

ИФТ-нің бұл вариантында иммунды реагенттерді қатты фазаға бекітеді (жапсырады). Қатты фазаны дайындауға планшеттер, пробиркалар, домалақ шариктер; полистиролды, нейлонды, полиакриламидті пленкалар пайдаланылуы мүмкін.

ҚИФТ-ның барлық тәсілдерін, өз кезегінде, жүйелі (конкурентсіз) және конкурентті ҚИФТ деп бөледі. Конкурентсіз ҚИФТ-да реакцияға иммунореагенттерді дәйекті (кезекті, бірінен кейін-бірін) қосады. Олар бірімен-бірі қандай да бір компонент үшін конкуренцияға (бәсекелестікке) түспейді. Конкурентті ҚИФТ-да екі иммунологиялық бір типті реагенттерді (белгілі және анықталатын) реакцияға бір уақытта енгізгенде, олардың арасында гомологты компонентпен байланысу үшін бәсекелестік (конкуренция) туады.

Конкурентсіз ҚИФТ бірнеше кезеңде (фаза) жүргізеді, фазаның әрқайсысынан кейін, қосылмаған компоненттерді жуу арқылы алып тастайды.

ҚИФТ кезкелген вариантында реакцияның мына этаптары орындалады:

1. Сенсибилизация. Қатты фазаға антигенді немесе антиденені бекітеді. Еритін антигендер және антиденелер, белгілі бір жағдайда (рН 9,6) өздігінен қатты фазаға сорбцияланады (сіңеді, жұтылады). Корпускулярлы антигендерді (бактериялар) глутаральдегидтің ерітінділерімен (0,1-0,2%-дық ерітінді) фиксациялайды, артынша кептіреді.

2. Сенсибилизациядан кейін, қатты фазаның бос қалған бетінде, реагенттердің спецификалық емес байланыстарын болдырмау мақсатында, өгіздің сарысулық альбуминінің 1%-дық ерітіндісін, жылқының қан сарысуын немесе ионогенді емес детергенттерді (детергенттер – жуушы, тазалаушы заттар) (0,05-0,5%-дық Твин 20, тритон Х-100) пайдаланады.

3. Жүйеге ферментпен тамғаланған иммунореагент – конъюгат қосады. Иммунореагенттерді мынадай ферменттермен жиі тамғалайды: хреннің (желкектің) пероксидаза ферменті (субстрат – Н2О2 ортофенилдиаминмен-ОФД), сілтілі фосфатаза (субстрат – паранитрофенилфосфат – ПНФФ).

4. Инкубирлегеннен және жуғаннан кейін планшеттің ойықтарына хромогенді субтратты енгізеді. Ойықтардың ішіндегілер боялғаннан кейін реакцияны Н2SO4 ерітіндісін енгізіп тоқтатады.

5. Ойықтардағы реагенттердің оптикалық тығыздығын өлшейді.
Практикада ҚИФТ-ң тура және тура емес варианттарын қолданады. Тура емес ҚИФТ антитүрлі конъюгаттарды пайдаланады. Реакцияның «сэндвич-варианты» кеңінен қолданылады. Бұл жағдайда, реакция барысында антиген антиденелердің екі қабатының ортасында қалады. «сэндвич-вариантта» падаланылатын антиденелер , бірімен-бірі антиген үшін бәсекелеске түспеу керек. Ірі молекулалы антигенде жоғарғы (ферментпен тамғаланған антиденелер) және төменгі (қатты фазаға сіңірілген) қабат бірдей болуы мүмкін. Шағын антигенді жағдайда, антиденелердің конкуренциясын болдырмау үшін, әр түрлі антиденелердің жұптарын пайдаланады.

Тура емес ҚИФТ қояр алдында, реагенттердің оптимальді концентрациясын тура ҚИФТ анықтайды:

-коъюгаттың белгілі бір сұйылтуында қан сарысуының оптимальды сұйылтуын таңдау;

-антигеннің оптимальды концентрациясын табу (антиденелер анықталған кезде қатты фазаны сенсибилдеу үшін).

Алдын ала тәжірибеде, қатты фазаны сенсибилдеу үшін, АГ оптимальды концентрациясын анықтайды.

Ойықтарды, бірінші бағаннан (1А...1Н) басқасын, антигеннің оптимальды концентрациясымен сенсибилдейді (16-18 сағат, 4оС). Бірінші бағанның ойықтарына 100 мкл –ден ФБ-Т енгізеді.

Ойықтардағы компоненттерді алып тастайды және оларды үш қайтара ФБ-Т ерітіндісімен жуады.

Қатты фазаның бос учаскелерін ФБ-Т –дағы 1%-ды БСА тосқауылдайды. Әр бір ойыққа 200 мкл-ден ерітіндіні қосады, 1 сағат бойы, 37оС температурада инкубациялайды.

Ойықтардағы тосқауылдық ерітіндіні алып тастайды, үш қайтара жуады.

5-12 қатарлардың А – Н ойықтарына (1:100 – 1:12800) зерттелінетін және бақылау сарысуларының ФБ-Т сұйылтуларын енгізеді:

-зерттелінетіндер 5 – 12 қатарларының ойықтарына (А – Н);

-оптимальды сұйылтуда оң нәтижелі ойықтарға 2А – 2Н;

-(1:400) теріс нәтижелі ойықтарға 3А – 3Н және 4А – 4Н.

7. 1 сағат бойы, 37оС температурада инкубациялайды.

8. ФБ-Т үш қайтара жуу.

9. 1Е – 1Н ойықтарға жуатын буферді, ал барлық қалған ойықтарға 100 мкл-ден антитүрлі конъюгатты ФБ-Т дайындалған жұмыс дозасында қосады.

10. 1 сағат бойы, 37оС температурада инкубациялайды.

11. ФБ-Т үш қайтара жуу.

12. Барлық ойықтарға 100 мкл-ден субстратты қоспаны енгізеді, 15-30 минут, 20-22 оС температурада инкубациялайды.

13. Барлық ойықтарға 50 мкл-ден Н2SO4 енгізеді.

14. Ойықтардағы ерітінділердің оптикалық тығыздығын өлшейді.

Алынған нәтижелердің негізінде «оң» және «теріс» бақылаулардың оптикалық тығыздықтарының (ОТ) арифметикалық орташасын анықтайды, оларды зерттелінген қан сарысуының ОТ салыстырады. Егер сарысулардың оптикалық тығыздығы , теріс бақылаудың арифметикалық орташасының квадраттық ауытқуынан 2-3-ке жоғары болса сарысуды оң деп санайды.

Конкурентті ҚИФТ. Конкурентті ҚИФТ кезкелген варианттарының бірінші кезеңінде, белгілі иммунореагенттердің біреуі (антиген, антидене), қатты фазаны сенсибилдейді. Екінші кезеңде ойықтарға конъгатпен бірге белгілі иммунореагентке зерттелетін материалды енгізеді. Зерттелген материалда іздеген иммунореагент (антиген, антидене) болған жағдайда, қатты фазада сіңгенмен (сорбирленген) гомологты болса, ол конъюгатпен байланысу үшін бәсекеге (конкуренцияға) түседі. Бұл хромогенді субстратты қосқанда боялуды төмендетеді. Осыдан, ҚИФТ нәтижесін оң деп есептейді.

Иммуноблоттинг (ИБ).(ағыл.blot –«дақ») әдіс, электрофорез және ИФТ реакцияларын үйлестіруге негізделген. Бұл тәсілді, күрделі антигендерді пайдаланғанда серологиялық реакциялардың спецификалық оң нәтижесін алуға мүмкін емес жағдайда пайдаланады. Иммунды -блоттингті қойғанда, бірінші кезеңде – полиакриламидті агар геліндегі иммунды –электрофорез әдісімен күрделі антигенді фракцияларға бөледі. Екінші кезеңде – жекеленген белдеулер (дақтар) түрінде фракцияланған антигендік пептидтерді нитроцеллюлозалық мембранаға орналастырады, содан кейін ферментпен, флюорохроммен немесе изотоппен тамғаланған антиденелермен айқындайды. Реакцияның оң нәтижесі – фильтрде бір немесе бірнеше боялған дақтардың (белдеулердің) пайда болуымен сипатталады (Сурет)

Әдетте бұл әдіспен ИФТ-нің «оң» нәтижесін қайта тексереді, себебі ИБ аса сезімтал және тәндік (сецификалық) қасиеті жоғары ( бір мезгілде , бірденнен қоздырғыштың бірнеше антигендеріне қарсы антиденелерді анықтауға мүмкіндік береді).Дегенмен, реакцияны қою өте күрделі де және қымбатқа түседі.