15-ші тақырып Агглютинация реакциясы. Тура емес гемагглютинация реакциясы. Сабақтың мақсаты

Құрал-жабдықтар мен материалдар. ЕПС -дағы токсині бар Cl.perfringens-тің өсіні; центрифугалар; центрифугалық пробиркалар; стерильді бактериологиялық пробиркалар; стерильді физиологиялық ерітінді; воронка-кұйғыштар; мақта-дәке сүзгілер; стерилизатор; шприцтер-инелерімен ; Cl.perfringens-тің антитосикалық қан сарысулары; 16-18 г салмақтағы ақ тышқандар; бірыңғай бруцеллездік антиген; сальмонелланың вакциндік штаммы (ТС-177); 96%-дық этанол; фосфатты-тұзды буферлік ерітінді (рН 7,2-7,4); ылғалды камера - Петри табақшалары, эксикатор; бруцеллаларға немесе сальмонеллаларға қарсы қоянның люминесценттік қан сарысулары; люминесценттік микроскоп; флуоресценция бермейтін иммерсиялық май; спектрофотометр (Multiskan PLUS, Labsystems); тегіс түпті 96- ойықты планшет; рН-метр; таразылар; пробиркаларға-штатив; көпканалды пипеткалар үшін ванналар; көпканалды пипеткалар (50-200 мкл); көлемін автоматты реттейтін пипеткалар, ұштарымен (10-1000 мкл); сорғыш қағаздар; ФАӘ планшеті-нәтижелерімен; ФАӘ ерітінділері: фофатты буферлі ерітінді (ФБ)- рН 7,4; 0,05% Твин-20 детергенті қосылған ФБ-(ФБ-Т); фосфатты-буферлі ерітіндідегі 0,05%-ды өгіздің қансарысуының албумині (ӨҚА); ) 0,05 М рН 9,6 карбонатты-бикарбонатты буферлік ерітінді (КББ); субстратты-цитратты буферлік (ЦБ) ерітінді, рН 5,0; ортофенилдиамин (ОФД) қосылған субстраттық қоспа; ферментативті реакцияны тоқтату үшін H2SO4 ерітіндісі.

Студенттердің өзіндік жұмысына арналған тапсырмалар. 1.ФАӘ –нің тура және екі кезеңдік тәсілімен бруцеллездің немесе сальмонеллездің қоздырғыштарын идентификациялау (анықтау). 2. ФАӘ нәтижелерін талдау. 3. Бактериалық токсиндерді бейтараптау реакциясын қоюды меңгеру.

Бақылау сұрақтары. 1. ФАӘ –нің бір кезеңдік (тура) және екі кезеңдік тәсілдерінің мәне неде? 2. ФАӘ –ні қандай мақсатта қояды? 3. ИФТ-ның тығыз фазалық тәсілінің мәні неде? 4. ИФТ –ні қандай мақсатта қояды? 5. Антитоксиндік қан сарысуларын қалай алады? 6. Иммунноблотинг және бактериалық токсиндерді бейтараптау реакциясының мәні неде?

Флуоресценциялаушы антиденелер әдісінде (иммунофлуоресценция реакциясы) флуорохроммен боялған антиденелер пайдаланылады. Флуорохром – ультракүлгін сәулелердің әсерінен сәулелі жарық шығаратын қасиеті бар бояғыш зат. Флуорохром ретінде объектіге зүбәржат(изумруд)-жасыл түс беретін флуоресцеиннің изотиоцианаты жиі қолданылады. Антидене+флуорохром комплексін конъюгат немесе люминесценттеуші сарысу деп атайды. ФАӘ зерттелінетін материалдағы микробтың антигендерін идентификациялауға және де жануарлардың қан сарысуларындағы антиденелерді анықтауға қолдануға болады. ФАӘ әдісінің бірнеше вариаттары әзірленген.

ФАӘ-нің тура варианты.

Бұл вариантты флуорохроммен таңбаланған (боялған) диагностикалық антиденелердің көмегімен белгісіз микробтың антигенін идентификациялауға (анықтауға) пайдаланады. (Сурет).

Жұмыс барысы.

1-ші кезең. Таза, майсызданған заттық шыныға зерттелінетін материалдан таңба-жағындылар немесе анықталынатын бактерия өсінінен жағынды дайындайды. Препаратты ауада кептіреді, ацетонмен (5 мин) немесе этанолмен (10-15 мин) фиксациялайды (бекітеді).

2-ші кезең. Бекітілген препараттың үстіне зерттелініп отырған антигенге қарсы белгілі антиденесі бар люминесцирлеуші иммунды сарысуды (жұмыстық сұйылтуында) тамызады. Реагенттердің кеуіп кетуін болдырмау мақсатында, препаратты сумен ылғалдандырылған сорғыш қағазы бар ылғалды камераға ( Петри табақшасы, эксикатор) орналастырады, термостатта 37-38оС, 15-30 мин ұстайды.

3-ші кезең. Байланыспаған иммуноглобулиндерді жою үшін препаратты 5-10 мин сумен (рН 7,0-ден төмен емес) жуады, кептіреді және люминесценттік микроскоппен қарайды.

Жарқырау қарқындылығын төрт-крестік жүйемен бағалайды:

4 крест (++++) – микроб клеткасының перифериясы (шеткері бөлігі) өте ашық флуоресценция береді, клетканың ортасы күңгірттеніп көрінеді;

3 крест (+++) – микроб клеткасының перифериясы (шеткері бөлігі) өте ашық флуоресценция береді;

2 крест (++) - микроб клеткасының перифериясы (шеткері бөлігі) әлсіз жарық береді;

1 крест (+) – микроб клеткасының перифериясының, оның ортаңғы бөлігімен салыстырғанда контрастық жарқырауы жоқ;

(-) – жарқырау жоқ (микроб клеткасының көлеңкесі көрінеді).

Мал ауруларының әртүрлі қоздырғыштарын анықтауда, реакцияның «оң» нәтижесі ретінде - 4 (++++) және 3 (+++) крест берген сынамаларды есептейді.

ФАӘ –нің дәлділігін растау үшін бақылаулар қою керек. Реакцияның тура вариантында мына бақылауларды қолданады: -антигендік жағынан гомологты және гетерологты микроорганизмдерді люминесцентті сарысумен өңдейді. Бірінші жағдайда – ашық жарқырау болуы тиіс (позитивті бақылау), екінші жағдайда – жарқырау жоқ (негативті бақалау).
ФАӘ-нің екі сатылы тура емес варианты.

Иммунды флуоресценция реакциясының бұл варианты көптеп әмбебап, себебі бір ғана люминесцирлеуші (антитүрлі) қан сарысуымен микроорганизмдердің әр түрлі түрлерін идентификациялауға болады. Антитүрлі сарысу– қай малдан таңбаланбаған иммунды антибактериальды сарысу алынды соның иммуноглобулиндеріне қарсы флуорохроммен таңбаланған антидене (бірінші сатыдағы қан сарысуы).

Жұмыс барысы.

1-ші кезең. Зерттелінетін материалдан дайындалған, бекітілген жағындыға таңбаланбаған антибактериальды сарысуды (1-ші сатыдағы қансарысуы) жұмыс дозасында тамызады. Препаратты ылғалды камерада 37-38оС 15-30 мин ұстайды. Антибактериальды иммунды сарысудың оптимальды (жұмыс) дозасын, оны алдын ала титрлеу арқылы анықтайды.

2-ші кезең. Препаратты сумен жуады (ФАӘ тура вариантын қара), кептіреді. Жағындыға люминесцирлеуші антитүрлі сарысуды (2-ші сатыдағы сарысу) тамызады. Мысалы, егер 1-ші сатыдағы сарысу қояндікі болса, онда антитүрлі сарысудың қоянның иммуноглобулиндеріне қарсы антиденесі болуы керек. Препаратты ылғалды камерада 37-38оС 15-30 мин ұстайды.

3-ші кезең. Препаратты сумен жуады (жоғарыдағыдай), кептіреді және микроскоптайды. Егер зерттелінген материалда іздеп отырған микроб (антиген) бар болса, онда 1-ші сатыдағы антиденелер солармен (антигендермен) байланысады және бұл келесі сатыда антитүрлі сарысу үшін антиген фукциясын атқарады.

Екі сатылы ФАӘ –ін зерттелетін қан сарысуындағы антиденелерді табу үшін қолдануға болады. Бұл үшін алдымен заттық шыныға белгілі микроб антигенін бекітеді (фиксация), сонан соң бірінші сатыдағы сарысу ретінде препаратқа зерттелінетін қан сарысуын, кейіннен тиісті антитүрлі люминесцирлеуші сарысуды тамызады.

ФАӘ-нің екі сатылы тура емес вариантының бақылаулары:

1) антигендік жағынан гомологты және гетерологты микроорганизмдері бар жағындыларды антитүрлі люминесцирлеуші сарысулармен өңдейді. Бактериялар клеткалары люминеценция бермеуі керек.

2) антигендік жағынан гомологты және гетерологты микроорганизмдері бар жағындыларды иммунды (антимикробты) сарысумен (бірінші этап) өңдейді, сонан соң флуоресцирлеуші антиглобулинді (антитүрлі) сарысуды (екінші этап) тамызады.

Бірінші жағдайда – ашық жарқырау болуы тиіс (позитивті бақылау), екінші жағдайда – жарқырау жоқ (негативті бақалау).
Препараттарды микроскопиялық зерттеу

Препаратқа глицеринді 9:1 қатынасында(фосфатты буферлі -рН 8,0) тамызады, үстін жапқыш шынымен жабады, бетіне флуоресценция бермейтін иммерсиялық май тамызады. Микроскопияны объективтің х90, окулярдың х4 немесе х5 ұлғайтуларымен, СЗС-7 немесе СЗС-14, БС-8, ФС-1 немесе ФС-2 жарықсүзгіштерімен жүргізеді.

Иммунды ферментті талдау (ИФТ).