15-ші тақырып Агглютинация реакциясы. Тура емес гемагглютинация реакциясы. Сабақтың мақсаты

1. АР антигендердің қандай типтері қолданылады?

2. Агглютинация феноменінің мәні неде?

3. Сандық және сапалық агглютинация реакциясы (АР) деген не?

4. Белгісіз микроорганиздерді АР-мен қалай анықтайды?

5. Қан сарысуының титрін пробиркалық АР қалай анықтайды.

6. ТГАР-ға эритроцитарлы диагностикумды қалай алады?

7.Сероконверсия деген не?

8.Иммунитет реакциялары дегеніміз не?
Иммунитет реакциялары дегеніміз антиген мен антидененің өз-ара іс қимыл нәтижесінің көрінісі, феномендері. Иммунитеттің барлық реакциялары жоғары сезімталдығымен және спецификалылығымен сипатталады осы себепті оларды инфекциялық ауруларды балау үшін қолданады.

Иммунологиялық реакциялар мына жағдайларға пайдаланылуы мүмкін:

1- ауру организмнен немесе қоршаған орта объектілерінен бөлінген қоздырғыштардың антигендерін анықтауға;

2- ауру немесе реконвалесцент малдың қан сарысуынан антиденені табуға.

Бірінші жағдайда, белгісіз антигенді белгілі антидене (диагностикалық қан сарысуы) арқылы анықтайды. Екіншісінде – белгісіз антиденені белгілі антиген (дигностикум) көмегімен анықтайды.

Иммунитет реакциясы екі фазада өтеді:

-бірінші фаза – антиген мен антидененің спецификалық өз-ара іс қимылы, оның нәтижесінде иммундық комплекс (антиген-антидене) түзіледі;

-екінші фаза – көзге көрінетін өзгерістердің тууы (агглютинация – ұлпалардың түзілуі, преципитация – тұманды сақина түзу т.с.с.).

Маңыздылардың бірі, ол ауру қоздырғыштарының антигендерін иммундық әдістермен анықтау болып табылады. Оларды жаңа ғана инфекциялық процестің басталған кезінде экспрес-әдістер көмегімен аықтау мүмкіндігі бар.

Микроорганизмдер антигендерінің спецификалық (тәндік) қасиеті бар. Сонымен қатар, бактериялық антигендер бір туыстықтағы бірнеше микроорганизмдерге, систематикалық категорияларға жалпы ортақ антиген де болуы ықтимал. Мысалы, бүткіл туысына, тұқымдастығына, түріне тән антигендер бар. Түр ішінде әртүрлі серологиялық топтар (серотоптар), варианттар (сероварлар) немесе типтер (серотиптер) болуы мүмкін.

Иммунологиялық әдістерді қолданғанда реакциялардың жалған-позитивті нәтижелері де болуы мүмкін. Барлық жағдайларда, оны антиген мен антидененің спецификалық емес байланысунан немесе антигендердің антиденелермен айқас реакциялары нәтижесінен деп түсіндіріледі. Жалған-негативті нәтижелер спецификалық антиденелердің немесе антигендердің санының сынамада жеткіліксіздігінен деп тұжырымдайды. Және де анықтау әдісінің сезімталдығының жеткіліксіздігінен де болуы мүмкін.

Антиденелердің санын анықтау үшін реакция титрін (оң нәтиже беретін қан сарысуының ең жоғары сұйылтылуы), сонымен қатар титрдің артуын (жұп қан сарысуын зерттеу арқылы) анықтайды. Ол үшін, бірінші қансарысуын ауру малдан аурудың бастапқы кезеңінде алады, 4-8⁰С температурада сақтайды, ал екіншісі – 10-14 тәулік өткеннен соң алынады. Қан сарысуларын бір-ақ сәтте зерттейді. Аурудың бар екендігіне екінші қан сарысуының титрінің біріншімен салыстырғанда төрт есе және одан да жоғары болуы (сероконверсия) дәлел бола алады. Бұндай зерттеудің нәтижесі тек 2 аптадан кейін белгілі болатындықтан, бұл әдісті, негізінде, ретроспективті диагностикада пайдаланады.

Антиденелердің қандай да бір иммуноглобулиндердің класына (IgM, IgG, IgA т.б.) жататындығын анықтау инфекциялық ауруды - иммунизацияланғаннан ажыратуға, бірінші рет ауыруды -қайталап ауырудан және инфекциялық процестің фазасын нақтылауға мүмкіндік береді.

Аурудың жіті өтуінде қан сарысуында IgM және басқа да ерте пайда болатын антиденелер ( төменгі авидті IgG сияқты ) анықталады.

Қайтадан инфицирленген организмде, созылмалы инфекцияда және микробты алып жүруде қан сарысуында IgG және IgA болады.

Егер мал бұрыннан ауырса немесе ол вакцинделген болса, онда тұрақты түрде IgG төменгі титрі анықталады.

Белгісіз антигендерді анықтау үшін диагностикалық иммунды қан сарысулары керек. Оларды алудың екі негізгі әдісі бар.

Диагностикалық қан сарысуларын алудың бірінші әдісі: бұнда, жануарларды (қояндар, жылқылар, есек) белгілі, қажетті антигендермен иммундейді. Егілген малда сол антигенге қарсы антиденелер синтезделеді. Содан кейін, малдың қанын алып оның сарысуын бөледі. Осындай жолмен дайындалған, өңделмеген (нативті) сарысуды адсорбцияланбаған деп атайды. Нативті қан сарысуында иммундеуге қолданылған микроорганизмнің барлық антигендеріне сәйкес антиденелер болады. Бұндай сарысулар төменгі сұйылтуларында өзімен тұқымдас, туыстас микробтармен топтық антигендердің болуы себебінен агглютинация беруі мүмкін.

Жеке антигендерге қарсы алынатын антиденелерді алу үшін, сарысуды Кастеллани әдісімен адсорбциялайды.

Мысал. Қоянды белгілі бір антигендік құрылысы бар (мысалы- а, в, с) 1-ші микробпен иммундегенде оның қансарысуында соларға сәйкес антиденелер құрылады. Алынған қан сарысуы 2-ші микробпен (антигендік құрылысы – с, б, е) өз-ара әрекеттескенде «С» антиденесі «с» антигеніне адсорбцияланады; қан сарысуында тек «А» және «В» антиденелері қалады. Қан сарысуын одан әрі антиденелердер арылту үшін оны 3-ші микробпен (антигендік құрылысы – а, г, д) әсерлестіруге болады. Онда «А» антиденесі «а» антигенге адсорбцияланады, сарысуда тек «В» антиденесі қалады. Осы қалған антиденені адсорбирленген деп атайды. Адсорбирленген қан сарысулары болуы мүмкін:

Монорецепторлы (моновалентті) – яғни бір антигендік рецепторға арналған антиденелері бар;

Поливалентті – бірнеше антигендерге арналған антиденелері бар.

Сонымен, диагностикалық агглютинациялаушы сарысулар мынадай болады:

нативті немесе адсорбирленбеген;

адсорбирленген (монорецепторлы және поливалентті).

Агглютинациялаушы диагностикалық сарысулардан басқа преципитациялаушы, лизистеуші, тамғаланған т.б. қан сарысулары бар.

Иммунделген жануарлардан алынған сарысуларды титрлейді, консерванттар қосады және стерилді жағдайда ампулаларға құяды. Сарысуларды сұйық және құрғақ күйде шығарады.

Диагностикалық қан сарысуын алудың екінші жолы - бұл әдісте гендік-инженерлік әдіспен алынған гибридомалар қолданылады. Гибридомалар – иммунды В- лимфоциттер мен миеломдық (ісік) жасушалардың гибридтері. Олар тек қатаң спецификалық моноклональді антиденелерді синтездейді.

Ауру малдан антиденені анықтау үшін диагностикумдар (белгілі антигендер) қолданылады. Бұлар әртүрлі жолмен (спиртпен, формалинмен, қайнату т.б.) өлтірілген белгілі бір микробтардың жүзіндісі. Мысалы, іш сүзегінің диагностикумы – өлі іш сүзегі бактерияларының жүзіндісі. Қазіргі кезде диагностикумдардың басқа да варианттары шығарылып жатыр:

лизатты – нативті антигендердің қоспасын (лизистенген немесе ультрадыбыспен өңделген инфекция қоздырғышы) пайдалану;

рекомбинантты – генді-инженерлік жолмен алынған микробтың белгілі бір белоктік антигенінің аналогі- белогін пайдалану;

пептидті – химиялық жолмен синтезделген белоктардың фрагменттерін пайдалану.

Реакция корпускулярлы антигендердің антиденелермен in vitro жағдайында өзара әрекеттесуіне негізделген. Пайда болған АГ+АД комплексінің тұнбаға түсу қабілеті бар. Корпускулярлы антигендер ретінде бактерия жасушалары немесе микроорганизмдерден алынған және корпукулярлы тасушыларға (эритроциттерге, латекс бөлшектеріне және т.б.) сорбирленген (сіңдірілген) ерігіш антигендерді пайдаланады. Реакция барысында корпускулярлы антигендер бастапқыда гомологты антиденелермен (реакцияның көзге көрінбейтін - спецификалық фазасы) спецификалы байланысады. Сонан кейін, құрылған антиген+антидене комплексі ірі, көзге көрінетін , әрі қарай тұнбаға түсетін конгломерат (агглютинат) құрайды. Бұны агглютинация феномені деп атайды. Антигендер мен антиденелер тек электролиттердің (натрий хлоридінің 0,85% -дық ерітіндісі) қатысуымен байланысады. Агглютинация реакциясын қоюдың, зерттеу мақсатарына және қою әдістеріне байланысты бірнеше тәсілдері бар.

1- белгілі агглютинациялаушы диагностикалық қан сарысуының тамшысы; 2- физиологиялық ерітіндінің тамшысы (бақылау ретінде) бөлек тамшы тамызады. Сонан кейін, зерттелініп отырған микробтың ЕПА колониясынан микробтық массаны бактериологиялық ілмекпен алып 1-ші тамшыға –( иммунды сарысу) араластырады (гомогенді жүзінді алғанша), содан соң тура алғашқыдай 2-ші тамшыға да микроб массасын қосып араластырады. Реакция нәтижесін 2-4 минуттан кейін қарайды. Бақылау (2-ші) тамшыда өзгеріс болмау керек. Ал иммундық сарысу тамшысында (егер бактерия өсіні антиденемен сәйкес болса) агглютинат пайда болады («оң» нәтиже). Агглютинация феномені болмаған жағдайда , зерттелініп отырған микроб өсіні иммундық сарысуға сәйкес емес деп қорытынды береді.

Мысалы, бруцеллезге диагноз қойғанда реакцияны былай жүргізеді. Заттық шыныға 0,3 мл зерттелініп отырған малдың қан сарысуын және 0,03 мл бруцеллез антигенін (роз-бенгалмен боялған бруцелла жасушалары) тамызады, жайлап шыныны шайқай отыра компоненттерді араластырады. Нәтижесін 4 мин өткеннен соң қарайды. «Оң» нәтижеде - агглютинаттар түйіршіктер түзеді. Бұндай жағдайда серологиялық реакцияларды сапалық реакциялар дейді, себебі бұның көмегімен қан сарысуындағы микробқа қарсы антиденелерді анықтауға болады, бірақ сол антиденелердің санын нақты анықтау мүмкін емес. Инфекциялық ауруларды мал организмінің қансарысуындағы антиденелерді белгілі микроб антигенінің көмегімен табу арқылы балауды серологиялық диагностика деп атайды.

Бұл әдісті қан сарысуындағы антиденелерді табуға және олардың сандық мөлшерін бағалауға пайдаланады. Пробиркалық агглютинация реакциясы адам және жануарлардың бруцеллез, листериоз, сальмонеллез және тағы басқа зооантропоноз ауруларын балаудағы серологиялық реакциялардың классикалық әдісі болып табылады. Реакцияны қою техникасын бруцеллезді серологиялық балау мысалымен қарастырамыз.

Реакцияның компоненттері:

- стандартты корпускулярлы бруцеллездік антиген;

- фенолды (0,5%), натрий хлоридінің ерітіндісі (сұйылтқыш);

- зерттелінетін қан сарысуы;

- негативті және позитивті (бруцеллездік) бақылау қан сарысулары;

Реакцияны 1 мл көлемде қояды. АР қою және нәтижелерін есепке алу № 1 -2 кестеде көрсетілген.

Кесте -1 -АР пробиркада қою схемасы

Компоненттер	Пробиркалардың нөмірлері және компоненттердің дозалары (мл)
	1	2	3	4	5	6
Натрий хлориді	2,4	-	0,5	0,5	0,5	0,5
Зерттелетін қан сарысуы	0,1*	Тасымал 0,5мл	0,5мл	0,5мл	0,5мл*	-
Алынған қан сарысуының сұйылтылуы	1:25	1:25	1:50	1:100	1:200	-
Бруцеллез антигені	-	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Қан сарысуының соңғы сұйылтылуы	1:25	1:50	1:100	1:200	1:400	-

Ескерту: * №1 және №5 пробиркалардан, қансарысуын араластырғаннан кейін 0,5 мл сұйықтықты алып тастайды.

Бастапқыда, зерттелінетін қан сарысуынан дәйекті , артушы, екі еселі 0,5 мл көлемде сұйылтулар дайындайды. Сонан соң барлық пробиркаларға бірдей мөлшерде, оптимальді концентрацияда бруцеллез антигенін қосады. Осы жағдайда сарысудың сұйылтылуы екі еселенеді.

Компоненттерді сілки-шайқап араластырады, 37оС температурада 16-20 сағат және 1 сағат - бөлме температурасында ұстайды, нәтижесін есепке алады.

Параллельді осыған ұқсас жолмен позитивті және негативті бақылау қан сарысуларын зерттейді.

Әрбір пробиркадағы реакцияның нәтижесін мына сызба бойынша «төрт плюс-крест» жүйесімен есепке алады:

«++++» - 100% - дық агглютинация – сұйықтың толық жарықтануы, антигеннің побирканың түбіне «қол шатырға» ұқсас шөгуі, шайқаған кезде тұнбаның мақта сияқты бөлшектенуі, сұйықтың мөлдір қалпында сақталуы;

«+++» - 75% - дық агглютинация - сұйықтың жартылай жарықтануы, нақты көрінетін «қол шатыр»;

«++» - 50% - дық агглютинация – сұйықтың ағаруы байқалады, «қол шатыр» орташа айқындықта көрінеді;

«+» - 25% - дық агглютинация – сұйықтың әрең байқалатын жарықтануы, «қол шатыр» әрең байқалады, шайқағанда аздаған агглютинация түйіршіктері көрінеді;

«-» - сұйықтың жарықтануы - жоқ, «қол шатыр» -жоқ, агглютинат түйіршіктері –жоқ.

Кесте - Реакция нәтижесін есепке алу сызбасы