15-ші тақырып Агглютинация реакциясы. Тура емес гемагглютинация реакциясы. Сабақтың мақсаты

Бейтараптау реакциясы (БР)

Бактериологияда бейтараптау реакциясын зерттелініп отырған материалда микроб токсиндерін анықтауға және оларды идентификациялауда пайдаланады. Бұл жағдайда микроб токсині антиген рөлін атқарады, ал диагностикалық иммунды (антитоксиндік) сарысудың құрамында осы токсинге қарсы антидене бар. Реакцияның принципі мынада: бірінші кезеңде зерттелетін материалда токсиннің бар-жоғын оны зертханалық жануарларға егу (құрсағына, тері ішіне) арқылы анықтайды. Егер материалда токсин болса жануар (құрсақ қуысына егу) өледі немесе егілген жерінде қабыну процесі жүреді және өліеттену (некроз) (тері ішіне еккенде) пайда болады. Екінші кезеңде зерттелетін материалды алдын-ала антитоксикалық сарысумен араластырып , инкубациялайды. Сонан соң қоспаны зертханалық жануарларға егеді. Нәтижесі: егілген жануарлар өлмесе, онда токсиннің (АГ) антитоксикалық сарысумен (АД) бейтараптанғанын көрсетеді. Реакция –оң, яғни белгілі сарысумен белгісіз антиген анықталды.

Бейтараптау реакциясы- бұл зертханалық тест. Онда иммундық қан сарысуындағы антиденелер микроорганизмдердің биологиялық белсенділігін (летальдығын, инфекция туғызу, тосикалық, ферментативті қасиеттері) бейтараптайды. БР мына мақсатта пайдаланады:

1) микроорганизмдерді сандық және сапалық анықтау үшін. Бұл мақсатта стандартты иммунды сарысуды (әр түрлі дозада) зерттелетін биоматериалмен немесе зерттелетін микроб өсінімен (әр түрлі дозада) араластырады. Қоспаны термостатта 30-60 мин ұстайды, сонан соң оны дайындалған тест-жүйеге (сезімтал жануарлар, тауық эмбрионы, клетка өсіндісі) егеді. Биологиялық нәтиже бақылау тобында (нормальды қан сарысуы + зерттелінетін материал) болып, тәжірибелік топта (иммунды сарысу + зерттелінетін материал) болмаса, онда зерттелінетін материалдағы антиген (АГ) мен иммунды сарысудағы антидене (АД) гомологты деп қорытындылайды. Сандық вариантта бейтараптау индексін (БИ) анықтайды. БИ –тәжірибедегі ЛД-50-дің бақылаудағы ЛД-50 –ге қатынасы.

2) токсинді немесе анатоксинді сандық және сапалық анықтау үшін. Зерттелетін субстрат немесе стандартты токсин in vitro жағдайында стандартты немесе зерттелетін антитокикалық сарысудың сұйылтуларымен араластырылады. Қоспаны термостатта 30-60 мин ұстайды және жануарларға егеді. Тәжірибе мен бақылау нәтижелерін салыстырады. Сандық тестіде, мысалы, антитоксикалық сарысуды титрлегенде бейтараптау индексін анықтайды.

3) бактерия ферменттерінің (гемотоксин, лецитиназа, гиалуронидаза, фибринолизин т.б.) бейтарапталуын анықтау үшін. Ауру малдың қан сарысуындағы антиферменттік антиденелердің титрін анықтау үшін пайдаланады. Бұл үшін, қан сарысуының әртүрлі сұйылтуларын дайындайды. Оларға стандартты ферменттің титрленген дозасын қосады, инкубациялайды және ферментке сәйкес субстрат енгізеді. Титрін белгілейді. Субстраттың ыдырауын тежейтін қан сарысуының ең жоғары сұйылтуын антидененің антиферменттік титрі деп есептейді. Диагностикалық жағынан алып қарағанда, қос қан сарысуындағы антидене (АД) титрінің артуының маңыздылығы зор.

19-шы тақырып

Жұқпалы ауруларды балауға, емдеуге және спецификалық

алдын алуға пайдаланылатын биологиялық препараттар

Құрал-жабдықтар мен материалдар. Доңыздың тілмесіне қарсы ВР-2 штаммынан дайындалған вакцина, сальмонеллезге қарсы ТС-177 вакцинасы, лептоспирозға, ботулизмге, пастереллезге, топалаңға, дерматофитоздарға, қойдың клостридиоздарына қарсы вакциналар. Доңыздың тілмесіне, пастереллезге қарсы емдік-профилактикалық иммунды сарысулар. Сальмонеллездің диагностикалық агглютинациялаушы және флюоресцирлеуші сарысулары. Диагностикалық аллергендер – бруцеллин, туберкулин, маллеин. Стерильді ЕПА, ЕПС, Кит-Тароцци , Сабуро орталары. Стерильді Пастер пипеткалары, физиологиялық ерітінді; иммерсиялық май (флуоресценция бермейтін); люминесценті микроскоп.

Студенттердің өзіндік жұмысына арналған тапсырмалар. 1. Доңыздың тілмесіне қарсы ВР-2 штаммынан дайындалған тірі вакцинаның тазалығына және зиянсыздығына бақылау жүргізу. 2. Инактивтелген сорбирленген, эмульгирленген және тірі вакциналардың үлгілерімен танысу.

Бақылау сұрақтары. 1. Вакциналардың қандай типтері бар? 2. Адъюванттар деген не? 3. Вакциналарды, емдік-профилактикалық және диагностикалық иммундық сарысуларды қалай бақылайды? 4. Моноклональды антиденелер негізінде дайындалған диагностикалық препараттардың артықшылығы неде?

Вакциналар. Вакцина (лат. vacca — сиыр, vaccіnus — сиырдікі) — микроорганизмдерден (бактерия, вирус, т.б.) алынып, жануарлар организміне жұқпалы аурулардан алдын ала сақтану және олардың иммундық қасиетін арттыру үшін егілетін биопрепараттар. Ауыл шаруашылық малдарының инфекциялық ауруларының алдын алу мақсатында қазіргі кезде вакциналардың бірнеше типтері пайдаланылады.

Инактивтелген вакциналар. Адъюванттар. Инактивтелген (белсенділігін жойған) вакциналардың құрамына адъюванттар қосады. Адъюва́нт (ағыл.:adjuvant -көмектесуші) — организмге иммуногенмен бірге енгізгенде иммундық жауапты күшейтетін құрамдастырылған заттар. Адъюванттардың иммуномодуляторлардан айырмашылығы, оларды иммундық жүйенің патологиясын қалыпқа келтіруге емес, керісінше, сау организмнің нақты иммундық жауабын күшейтуге,( мысалы, вакцинацияда) пайдаланады. Бейорганикалық адъюванттардан жиі қолданылатындарға алюминийдің гидрооксидін ( минеральды гель, алюмокалийлік ашудас) жатқызуға болады. Адъювантты вакциналарды дайындағанда - дайын микроб антигеніне оптимальды пропорцияда тиісті адъювантты қосады.

Жоғары нәтижелі адъюванттар қатарына стабилизатор- тұрақтандырғыш (сусыз ланолин) қосылған жеңіл минеральды майларды жатқызады. Антигеннің сулы суспензиясын және минеральды майды араластырып тұрақты сулы-майлы эмульсия дайындайды. Бұндай жолмен дайындалған вакциналарды эмульгирленген вакциналар деп атайды.

Инактивтелген корпускулярлы вакциналар - микробтың тұтас (ыдырамаған) инактивтелген жасушасынан тұрады. Бұларды дайындағанда, қоздырғыштың антигендік гетерогендігіне байланысты, құрамына микроб штамының бір немесе бірнеше сероварларын қосады. Және де бактерияның диссоциациялық қасиеті жоқ штамдарын пайдаланады. Бактериялық массаны вакциндік штамдарды сұйық қоректік орталарда (ферментерлерде) өсіру арқылы алады. Келесі кезеңде, бактерия жасушаларын физикалық (55-60оС қыздыру, ультрадыбыс, ультракүлгін сәулелер, иондаушы сәулелер) немесе химиялық (формалин, глутарлы альдегид, бета-пропиолактон, кристаллвиолет, метилен көгі т.б.) әдістерімен инактивтейді . Инактивацияның кезкелген әдісіне мынадай екі негізгі талап қойылады: 1) қоздырғыш жасушасының толық инактивтелінуі, 2) қоздырғыштың иммунологиялық және антигендік қасиеттері жағынан елеулі ауытқушылықтарының болмауы.

Инактивтегеннен кейін микроб клеткасының 1 мл сузпензиядағы керекті концентрациясын анықтайды, таңдалған адъювантты қосады, препаратты белгілі мөлшермен орап бақылайды.

Химиялық вакциналар – иммуноген ретінде микроб клеткасынан түрлі тәсілмен алынған әр түрлі химиялық қосылыстар пайдаланылады. Химиялық вакциналардың артықшылығы – иммуногенді компонентті микробтың басқа балластық заттарынан жеке бөліп алуға болатындығы. Бұл препараттың реактогендігін төмендетуге мүмкіндік береді. Бұлардың қатарына анатоксинвакцинаны да жатқызуға болады.

Анатоксинвакциналар - иммуноген болып бактериялардың формалинмен инактивтелген экзотоксиндері (анатоксин) саналады. Анатоксинвакциналарды дайындау үшін, қоздырғыштың токсинтүзуші штаммының өсінін , максимальды токсин жиналуын қамтамасыз ететін жағдайда, сұйық қоректік ортада өсіреді. Сонан соң культуральды сұйықты бактериальдық массадан бөледі, формалин ерітіндісімен әсерлеп экзотоксинді анатоксин қалпына ауыстырады.

Анавакциналар – кейбір вакциналарды дайындағанда микробтық массаны және токсинді бөлмейді, дайын препаратта инактивтелген микроб клеткасы және анатоксин (анавакцина) болады.

Тірі вакциналар – жасанды әлсіретілген немесе табиғи авирулентті (вируленттігі нашар), сезімтал жануарларда ауру тудыру мүмкіндігін жоғалтқан, бірақ белгілі бір уақыт аралығында вакцинденген организмде көбейіп иммундық жауап туғызатын қоздырғыштың штаммдары. Вакциндік штамдарға қойылатын негізгі талаптар: 1) реверсияға (алғашқы вируленттік қалпына қайта келу) бейімділігінің жоқтығы; 2) контагиоздылық (аса жұғымталдық) қасиетінің болмауы (қоздырғыштың вакциндік штаммы вакцинденген малдан вакцинденбеген малға берілмеуі керек). Вакциндік штамның оны қоздырғыштың эпизоотикалық штаммынан ерекшелендіретін тұрақты маркері болғаны дұрыс.

Гендік-инженерлік вакциналарды патогендігі жоқ микроорганизмнің геномына ауру қоздырғышының белгілі бір генін немесе гендердің топтарын енгізу жолымен дайындайды. Мысалы, рекомбинантты штаммның иммуногендігін қамтамасыз ететін, протективті антигеннің синтезін бақылайтын гендерді енгізу. Гендерді тасымалдаушы (вектор) ретінде плазмидаларды немесе фагтарды пайдаланады.

Вакциналарды бақылауды үш негізгі көрсеткіштер (параметр) бойынша жүргізеді:

Стерильділігі (инактивтелген вакциналар үшін) немесе өсіннің тазалығы (тірі вакциналар үшін ) – қоректік орталарда өсіру арқылы бақылайды.

Зиянсыздығы (зарарсыздығы) –әр түрлі зертханалық жануарларға жұқтыру (егу) арқылы тексереді. Олар егілген жануарлардың ауыруын және өлімін туғызбау керек.

Спецификалық белсенділігін (иммуногендігін) –мынадай жолмен тексереді: вакцинаны лабораториялық жануарлар тобына егеді (вакциндейді), содан соң, белгілі бір уақыт өткеннен кейін (активті иммунитет түзілуге жеткілікті уақыт – 15-20 тәулік), осы вакцинделген топтың жануарларын бақылау тобының (вакцинделмегендер) жануарларымен бірге қоздырғыштың белгілі летальді дозасымен зақымдайды. Бақылау (вакцина егілмегендер) тобының жануарлары өлулері тиіс, ал вакцинделгендердің 80% және одан жоғарысы аман қалуы тиіс. Кейде иммуногендікті жанама әдістермен де - вакцинделген жануарлардың агглютининдерінің санымен (мысалы – лептоспироздың вакцинасы), БР көмегімен антитоксиндердің санын (мысалы – ботулизмге қарсы вакцина) анықтайды.

Вакцинаның тазалығын анықтау үшін құрғақ (лиофильденген) вакцинаны стерильді физиологиялық ерітіндімен сұйылтады (1:10). Бактерия жүзіндісінен жағынды жасайды, Грам әдісімен бояйды, микроскоптайды. Микроскоптың көру алаңында тек тілме қоздырғышына тән ұсақ, таяқша тәріздес, грам-оң бактериялар болуы керек. Бір мезгілде жүзіндіні ЕПА, ЕПС, Кит – Тароцци ортасына және Сабуро агарына себеді. Себіндіні 10 тәулік 37-38оС ұстайды. Саңырауқұлақтарды анықтауға арналған өсіндіні 15 тәулік, 20-25оС ұстайды. Барлық қоректік орталарда (ЕПА, ЕПС) тілме қоздырғышының типтік өсінінен басқа микробтар болмауы керек .

Вакцинаның зиянсыздығын (зарарсыздығын) және активтілігін (белсенділігін) бақылау үшін – 17-18 г салмақтағы 20 ақ тышқанға 0,2 мл-ден препаратты тері астына егеді. Егер егілген тышқандар (5-інен көп емес) өлсе, онда вакцинаны зиянсыз деп есептейді. 14 тәуліктен кейін вакцинделгендерден тірі қалғандардың барлығын және бақылау тобының бес тышқанын шошқа тілмесінің вирулентті штаммының летальді дозасымен егеді. Егер бақылау тобының тышқандары 3-4 тәулік арасында өлетін болса, ал (75%-дан төмен емес) вакцинденгендер тірі қалса онда вакцинаны активті деп есептейді.

Емдік- профилактикалық иммунды қан сарысулары және иммуноглобулиндер. Бұл қатардағы препараттарды пассивті (енжар) иммунитет жасау үшін қолданады. Пассивті иммунитет препаратты еккеннен соң 20-24 сағатта пайда болады және иммунитет 2-3 аптаға созылады. Иммунды қан сарысуларын антигенді продуцент малдарға (жылқы, өгіз т.б.) бірнеше мәрте егу арқылы алады. Антидененің деңгейі керекті максимальды титрге жеткенде егілген малдан қан алады, сарысуын алу үшін құрамындағы заттарды бір-бірінен айырады (сепарирлеу), сарысуды фильтрлеу арқылы стерильдейді және 0,25-0,5%-дық фенол, 0,01-0,3%-дық тиомерсал ерітінділерімен немесе басқа заттармен консервирлейді.

Иммунды қан сарысуларын, әсер ету бағытына қарай - антибактериальдық, антитоксикалық, антивирустық топтарға бөледі.

Иммунды сарысуларды бақылауды үш негізгі көрсеткіштерді анықтау бойынша жүргізеді:

Стерильділігі - ЕПА, ЕПС, ЕПБС, Сабуро агары немесе Чапек орталарына себу арқылы анықталады.

Зиянсыздығы (зарарсыздығы) –әр түрлі зертханалық жануарларға егу арқылы тексереді.

Спецификалық белсенділігін (иммуногендігін) – зертханалық жануарларға егу арқылы тексереді.

Иммунды қан сарысуының превентивті (қорғаныш) қасиетін анықтау мақсатында зертханалық жануарларға немесе табиғи сезімтал жануарларға сарысуды егеді (тері астына, бұлшық етке немесе құрсақ қуысына), сонан соң, 20-24 сағаттан кейін иммунделгендерді және бақылау (иммунделмеген) тобындағы жануарларды гомологты, вирулентті штаммның летальды дозасымен зақымдайды. Иммунделген жануарлар сау қалулары керек, ал бақылау тобындағылар - өледі немесе аурудың типтік клиникалық белгісін береді.

Сарысудың антитоксикалық және антивирустық қасиетін бейтараптау реакциясымен (БР) анықтайды. Антиденелердің титрін КБР, АР, ТГАР, ДПР көмегімен анықтайды.

Емдік- профилактикалық сарысуға (шошқаның тілмесіне қарсы) бақылау жүргізу мысалы.

Стерильділігін бақылау: сарысуды ЕПА. ЕПС, ЕПБС, Сабуро агарына себеді, себінділерді 37оС және 20оС-та (Сабуро ортасын – микроскопиялық саңырауқұлақтарға) ұстайды. Орталар стерильді күйін сақтау керек.

Зиянсыздығын бақылау: массасы 17-20 г болатын 5 ақ тышқанға, әрқайсысына 0,5 мл-ден және массасы 250-300 г болатын екі теңіз шошқасына – 10 мл-ден тері астына сарысуды енгізеді. Барлық егілген малдар 10 тәулік бойы тірі қалулары керек.

Белсенділігін (активтілігі) бақылау: массасы 17-20 г болатын 15 ақ тышқанға 0,01, 0,02 және 0,03 мл (әр дозаға 5 тышқаннан) құрсақ қуысына егеді. Содан кейін, 2 сағат өткеннен соң барлық егілгендерге және 5 егілмегендерге (бақылау) тері астына 0,1 -0,2 мл-ден тілме қоздырғышының тәуліктік вирулентті өсінін 1:200 сұйылтуында егеді. Егер 10 тәулік бойында барлық егілген жануарлар тірі қалса, ал бақылаудағылар – өлсе, онда иммунды сарысу активті (белсенді) деп есептеледі.

Антиденелерді қойылту және серологиялық активті емес альбуминдерді жою үшін, иммунды сарысудың ақзаттарының глобулиндік фракциясын бөлуге арналған әдістерді пайдаланады. Дайын иммуноглобулиндік препараттарды, иммундық сарысуларға жүргізгендей – стерильділігіне, зиянсыздығына және спецификалық белсенділігіне бақылау жүргізеді.

Диагностикалық иммунды сарысулар және глобулиндер. Бұларды дайындау принципі емдеу-профилактикалық сарысулардағыдай, бірақ диагностикалық сарысулар серологиялық реакцияларда тек активтілігімен ғана емес, жоғары тәнділігімен де (спецификалық қасиеті) сипатталуы керек.

Диагностикалық сарысулардың көмегімен – зерттелінетін материалдағы микробтардың антигендерін және бөлінген микроорганизмдердің түрін анықтайды. Олар, түрлік сарысулар (микроорганизмдерді түр деңгейіне дейін анықтауға арналған), топтық сарысулар (серологиялық топ деңгейіне дейін анықтауға арналған), сероварианттық сарысулар (серовар деңгейіне дейін анықтауға арналған) болып бөлінеді. Иммунды сарысуларды әр түрлі серологиялық реакцияларда (АР, ПР, КБР, ТГАР, БР, ИФР) пайдаланады. Флуорохроммен және ферменттермен тамғаланған антиденелерді алғанда, алдымен иммунды сарысулардан иммундыглобулинді фракцияны бөліп алады және тазартады. Диагностикалық сарысуларды стерильділігіне, активтілігіне және спецификалық қасиетіне бақылау жүргізеді.

Диагностикалық сарысудың белсенділігіне бақылау жүргізу жолы (люминесцирлеуші сальмонеллездің сарысуына).Сальмонеллез қоздырғышының 24 сағаттық агар ортасындағы өсінінен жағындылар дайындайды, оларды фиксациялайды, әр бір жағындыға гомологты флуоресцирлеуші сарысулардың әртүрлі сұйылтуларын тамызады. Әрі қарайғы жұмыс тақырыптың алдыңғы бөлігіндегідей жүргізіледі. Жағындыларды люминесцентті микроскопта қарайды. Гомологты микроб клеткасының үш-төрт крест дәрежесінде жарқырауық беруін қамтамасыз ететін сарысудың ең жоғарғы сұйылтуын оның бояғыш титрі деп есептейді. Сарысудың жұмыс титрі , яғни жұмысқа пайдаланатын, оның бояғыш титрінің жартысына тең.

Люминесцирлеуші сарысудың спецификалығына (тәнділігіне) бақылау : заттық шыныларға гетерологиялық (сальмонелла және эшерихияның жағындыларын дайындайды. Оны флуоресцирлеуші сарысудың жұмыс титрімен әсерлейді. Гетерологты микробтар жарқырауық бермеуі тиіс.

Моноклональды антиденелерді алу үшін, белгілі бір арнайы (спецификалық) бағыттағы антиденелерді синтездейтін лимфоциттер қатарын бөліп алады және сақтайды. Антидене өндіруші (продуцент) – жасушалар in vitro өсуге қабылетті емес.

Қатерлі ісік (миелома) жасушалары көп мөлшерде аномальды иммуноглобулиндерді синтездейді. Олар in vitro шексіз өсуге қабылетті. Миелома жасушаларын лимфоциттермен қосу (біріктіру) әдісі әзірленді. Бұл ретте гибридтік жасуша (гибридома) , ісік жасушасы сияқты - шексіз өсуге қабылетті және сонымен бірге, лимфоидті жасушалар сияқты - антиденені де синтездейді (өндіреді). Моноклональды антиденелерді алу бірнеше кезеңдерден тұрады:

Белгілі антигенмен жануарларды иммундайды. Содан кейін көкбауырдан В-лимфоциттерді бөледі.

В-лимфоциттер мен миеломдық жасушаларды қосады (гибридизациялау). Гибридтік лимфоциттер мен миеломдық жасушалардың қоспасы алынады.

Жасушалар қоспасын құрамында ГАТ (гипоксантин-аминоптерин-тимидин) бар ортада өсіреді. Бұл жағдайда – миеломды жасушалар және лимфоциттер өледі. Себебі көрсетілген ортада тек гибридомалар өсе алады.

Гибридомдық жасушаларды микрокультивирлеуге арналған планшет ойығында тек бір жасуша болатындай етіп оларды клондайды (себеді). Жасушалар өскеннен кейін, олардың керекті антиденелерді синтездеу мүмкіншіліктерін бағалайды (скрининг жүргізеді). Клонирлеуді қайталайды. Сайып келгенде берілген тәнділігімен тұрақты клонды таңдайды . (Сызба).

Моноклональды антиденелерді не культуральды сұйықтықтан (гибридомдық жасушаларды in vitro өсіреді) не асциттік (іш шемені, жалқаяқ) – сұйықтықтан (гибридоманы in vivo өсіреді) бөледі.

Моноклональды антиденені алу схемасы